Enregistrement colorant sensible à la tension d'axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Le but général des expériences décrites est de surveiller optiquement, avec une résolution submicrométrique et submilliseconde, l'intégration des signaux du potentiel membranaire et le traitement de l'information par une cellule nerveuse individuelle, à partir de plusieurs sites sur un neurone. Ceci est réalisé en premier lieu en montant un dispositif d'imagerie doté d'une sensibilité appropriée permettant l'enregistrement de faibles variations fractionnelles de l'intensité lumineuse correspondant aux transitoires du potentiel membranaire. Ensuite, sélectionnez les neurones possédant une anatomie adaptée pour une imagerie efficace, c’est-à-dire des neurones présentant de longs prolongements intacts dans un plan focal unique proche de la surface de la tranche.

Ensuite, chargez les neurones pré-sélectionnés avec des colorants sensibles au voltage afin de permettre le suivi optique des variations du potentiel membranaire. Les résultats montrent la capacité unique de cette approche à obtenir des informations sur l'intégration des signaux électriques par des cellules nerveuses individuelles en surveillant les signaux de potentiel membranaire provenant des axones, des dendrites et des épines dendritiques. En neurophysiologie cellulaire.

De nouveaux outils sont en cours de développement en raison des deux limitations persistantes de l'électrophysiologie conventionnelle : la faible résolution spatiale des mesures électrodes et l'impossibilité d'enregistrer des structures petites telles que les collatéraux axonaux ou les épines dendritiques. Pour surmonter ces inconvénients, l'approche par électrode de patch peut être combinée à des techniques optiques permettant des enregistrements parallèles provenant de toutes les parties d'un neurone. Nous décrivons ici une telle technique : l'enregistrement optique multiple sur les côtés des transitoires de potentiel membranaire avec une résolution au niveau de l'épine unique.

Dans cette expérience, un microscope droit et trois caméras sont utilisés pour régler un éclairage uniforme. Insérez d'abord un filtre neutre de densité approprié dans le trajet du faisceau laser. Ensuite, focalisez l'objectif sur la surface de la lame fluorescente standard.

En observant l'image CCD du champ de vision sur l'écran du moniteur, ajustez la position de l'extrémité réceptrice du guide de lumière en quartz ainsi que celle de l'extrémité émettrice du guide de lumière à l'aide des actionneurs appropriés du condenseur d'épi-fluorescence, afin d'obtenir un éclairage centré et uniforme du champ de vision. Pour déterminer le bruit vibratoire, utilisez une lame fluorescente standard munie d'une marque non fluorescente à sa surface. Enregistrez l'intensité lumineuse avec le CCD neuro en mode continu.

Placez l'objectif sur un bord sombre de la marque noire et enregistrez l'intensité lumineuse pendant environ 100 millisecondes à une fréquence d'acquisition de deux kilohertz. Ensuite, affichez la moyenne spatiale des traces d'intensité lumineuse relative provenant d'environ 20 pixels recevant de la lumière provenant d'une zone uniformément éclairée et d'environ 20 pixels situés le long du bord de la marque noire. Le bruit excédentaire dans la moyenne spatiale provenant des pixels présentant des bords à fort contraste reflète le bruit vibratoire du système.

Il est essentiel de monter l'obturateur mécanique en dehors de la table d'isolation vibratoire afin que l'ouverture de l'obturateur n'introduise pas de bruit vibratoire dans l'enregistrement optique. Cette étape est cruciale. Montez l'obturateur à l'aide de vis en plastique et de matériau d'isolation vibratoire afin de réduire le bruit vibratoire acoustique pouvant être capté par le système d'enregistrement optique.

Pour isoler les vibrations, ajustez la table d'isolation des vibrations jusqu'à ce que le bruit vibratoire des pixels couvrant le bord net de l'image soit inférieur au bruit de fond quantique. Les câbles des équipements sur la table doivent être détendus afin d'éviter la transmission des vibrations mécaniques au microscope. Dans cette procédure, préparez des tranches de cerveau d'une épaisseur de 300 à 400 microns selon les procédures standard, en utilisant une lignée de souris exprimant EGFP dans des cellules nerveuses individuelles d'intérêt, à l'aide d'un système confocal à disque tournant.

Visualisez les neurones marqués par la EGFP dans la coupe. Ensuite, sélectionnez les neurones possédant des arbres dendritiques et axonaux intacts, dont les prolongements sont parallèles et proches de la surface de la coupe, pour l'imagerie du potentiel membranaire. Remplissez ensuite une pipette de patch en verre à partir de la pointe avec une solution intracellulaire sans colorant jusqu'aux deux tiers de la partie conique de l'électrode, en appliquant une pression négative pendant environ 15 secondes.

Ensuite, remplir le rétrograduellement l'électrode avec la solution contenant le colorant sensible à la tension du perméat IMP membranaire dissous dans la solution intracellulaire. Maintenant, réaliser un patch sur un neurone précédemment sélectionné dans l'minute suivant le chargement du colorant dans l'électrode. Appliquer une pression positive faible d'environ 10 millimètres de mercure avant d'abaisser la pipette dans le bain, et tout en positionnant l'électrode dans la tranche, ce qui garantit qu'aucun colorant ne s'échappe de l'électrode avant que le scellement soit établi.

Augmenter la pression jusqu'à environ 100 millimètres de mercure juste avant que l'électrode n'entre en contact avec la surface de la cellule. Pour établir le scellement en configuration tout-enregistrement, permettre la diffusion libre du colorant à partir d'une micropipette de patch somatique vers le soma pendant 20 à 45 minutes. Pendant la diffusion du colorant, surveiller l'état physiologique du neurone en enregistrant les potentiels d'action évoqués en mode blocage de courant.

En outre, surveillez la quantité de marquage en enregistrant l'intensité lumineuse au repos provenant du soma cellulaire à une fréquence d'images de deux kilohertz et à une fraction de l'intensité lumineuse maximale ajustée à l'aide de filtres neutres. Poursuivez le processus de dialyse jusqu'à ce que le potentiel d'action commence à s'élargir. À la fin du marquage, retirez délicatement la micropipette du soma en configuration de blocage de tension afin de vous assurer que la transition de la configuration en cellule entière à celle de patch « outside-out » est bien obtenue au cours du processus.

Ensuite, incuber la coupe supplémentairement de 1,5 à deux heures à température ambiante afin de permettre au colorant sensible à la tension de se diffuser dans les prolongements neuronaux. Une fois qu'une quantité significative de colorant s'est diffusée loin du soma vers les prolongements dendritiques et axonaux, la forme du potentiel d'action devrait être complètement restaurée. À l'étape suivante, localiser le soma du neurone coloré sous fluorescence à faible intensité.

Réduisez l'intensité lumineuse à l'aide de filtres de densité neutre à la valeur minimale requise pour visualiser l'objet d'intérêt à l’aide d’un balayage XY de la lame. Balayez la zone de la coupe contenant le neurone fluorescent jusqu’à ce que le soma fluorescent soit identifié. Placez le soma de la cellule marquée au centre du champ du microscope, puis réalisez le bouchonnage du neurone avec une électrode de patch standard sans colorant en utilisant le contraste de phase interférentiel (DIC). Visualisez ensuite les prolongements neuronaux en fluorescence à faible intensité, à une fréquence d’image de 10 à 40 hertz, en mode d’enregistrement continu du CCD pour l’imagerie de tension.

À l’aide d’une position sur la platine XY, placer le processus neuronal d’intérêt au centre de la zone d’imagerie. En outre, protéger le corps cellulaire (SOMA) de la lumière d’excitation à l’aide du diaphragme champ fermé partiellement du microscope afin de réduire les dommages photodynamiques. Ensuite, enregistrer les signaux optiques associés aux potentiels d’action rétrogrades dans les branches dendritiques individuelles.

Ensuite, enregistrez les signaux optiques liés aux potentiels d'action dans l'axone. Après cela, enregistrez les signaux optiques liés aux potentiels d'action rétropropagés dans les épines dendritiques. Utilisez la fréquence d'images appropriée pour une reconstruction précise de la forme d'onde du signal.

En même temps, maintenir les périodes d’enregistrement et l’exposition à la lumière d’excitation de haute intensité aussi courtes que possible afin de minimiser la décoloration du colorant et les dommages photodynamiques. L’enregistrement des signaux optiques est montré ici. Le panneau supérieur montre l’image confocale haute résolution d’un neurone coloré avec son axone en position d’enregistrement.

Alors que le panneau central montre l'image de fluorescence à faible résolution spatiale de l'axone obtenue par CCD, utilisée pour l'imagerie du potentiel membranaire, le panneau inférieur présente les enregistrements électrodes provenant du soma ainsi que les enregistrements optiques provenant de l'ASI et du nœud de Ranvier. Les données brutes et les signaux traités sont affichés. Cette figure montre les signaux du potentiel d'action provenant de l'axone d'un neurone cortical de type L5 chargé avec le colorant sensible à la tension nommé action.

Des signaux potentiellement associés ont été enregistrés à une fréquence de 10 kilohertz. Ces tracés indiquent le transitoire du potentiel d'action provenant de trois emplacements. Premièrement, l'électrode enregistrant depuis le soma.

Deux, les enregistrements optiques provenant de l'axone hillock, et trois, l'enregistrement optique du premier nœud de vie, et voici les signaux superposés provenant de ces trois mêmes emplacements. Cette figure montre un sursaut de quatre signaux de potentiel d'action rétrogrades enregistrés en plusieurs points de l'arborisation dendritique d'un neurone cortical de type L cinq, déclenché par des impulsions courtes de courant dépolarisant à 100 hertz. Sont représentés ici les signaux de potentiel d'action provenant d'une épine dendritique individuelle.

Voici la reconstruction anatomique obtenue à partir d'une série d'images confocales à disque tournant, et voici l'image de fluorescence de la même région obtenue avec la caméra CCD. Pour l'imagerie du potentiel de membrane, les courbes d'intensité de fluorescence correspondant aux potentiels d'action rétrogrades provenant des emplacements un à trois, tels qu'indiqués sur l'image CCD, sont présentées dans le panneau de droite. La courbe inférieure indique l'enregistrement électrode du soma.

La préparation préalable à l’enregistrement prend environ trois heures, y compris la période d’attente nécessaire à la dispersion des dés vers les prolongements distaux. La durée de l’enregistrement est limitée par la dégradation normale de la préparation et par les dommages photodynamiques induits par le peroxyde d'hydrogène (PO). L'ampleur des dommages photodynamiques est proportionnelle à l'intensité de la lumière d'excitation, ainsi qu'à la durée et au nombre des essais d'enregistrement individuels.

Dans certaines expériences, il est possible d'effectuer plus de 50 essais d'enregistrement en une ou deux heures. D'autres mesures nécessitent une excitation élevée, des intensités lumineuses fortes et des enregistrements plus longs, et sont limitées par les dommages photodynamiques à seulement quelques essais d'enregistrement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'imagerie de potentiel sur toute la structure axonale et terminale de neurones individuels dans des tranches de cerveau.