Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

L'objectif général de cette procédure est d'observer des symbiotes bactériens marqués par fluorescence au sein de leur hôte nématode. Cela est réalisé en marquant d'abord les bactéries avec une protéine fluorescente par conjugaison. La deuxième étape consiste à isoler les nématodes AIC en récoltant les œufs.

Ensuite, les nématodes AIC sont cultivés en association avec leur symbionte bactérien marqué par fluorescence afin de permettre une association naturelle et, en fin de compte, la localisation du symbionte bactérien à l'intérieur de l'hôte nématode. La fréquence de cette association au sein de la population de nématodes peut être déterminée par microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des symbioses, telles que : où les bactéries se localisent-elles au sein de leur hôte, et quelle est la distribution du portage bactérien au sein d'une population hôte ?

Après une croissance nocturne des souches bactériennes, réaliser une sous-culture des souches donneur, receveur et auxiliaire dans un milieu de croissance riche en nutriments et dépourvu d'antibiotiques, selon un rapport de un à 100 entre la culture et le milieu, puis faire croître les cultures à la température appropriée pour chaque souche jusqu'à ce qu'elles atteignent une phase de croissance logarithmique moyenne. Ensuite, mélanger les souches dans un seul tube de microcentrifugeuse et centrifuger les cultures mixtes pendant deux minutes à 17 900 ×g, décantation du surnageant et resuspension du culot dans 30 microlitres de milieu frais. Puis déposer la suspension sur une boîte de milieu riche en nutriments sans antibiotiques, et laisser la goutte sécher une fois que la suspension est sèche.

Incubez la boîte renversée toute la nuit à une température optimale pour la bactérie réceptrice et compatible avec le donneur et l'aide si applicable. Prélèvez ensuite la tache et réalisez un isolement par stries sur une boîte contenant un antibiotique sélectif afin d'obtenir une culture pure de bactéries, sous forme d'une colonie isolée. Enfin, vérifiez que les colonies obtenues correspondent bien au symbiote récepteur et non à la souche donneuse.

En recherchant la présence de phénotypes spécifiques au receveur. Par exemple, les bactéries cino abdi peuvent être distinguées d’E. coli en effectuant un test au catalase, puis en recherchant la présence du plasmide en confirmant la fluorescence sous la longueur d’onde correspondant à la protéine plasmidique fluorescente. Après avoir fait croître le symbiote bactérien naturel pendant la nuit, déposer 600 microlitres de la culture bactérienne sur huit à dix aérosols lipidiques de 10 millimètres, puis incuber les boîtes à l’obscurité et sans humidité à 25 degrés Celsius.

Après deux jours, ajoutez 5 000 nématodes juvéniles infectieux dans 500 microlitres de milieu sur les pelouses bactériennes. Après avoir incubé les boîtes à 25 degrés Celsius pendant trois jours supplémentaires, déposez 20 microlitres d'eau sur une lame de microscope. Ensuite, utilisez un bâtonnet stérile pour prélever une petite quantité de nématodes à partir de la pelouse bactérienne.

Placer le morceau dans l'eau pour permettre aux nématodes de nager hors du tissu. Observer cette lame en faible grossissement. Si des œufs et des femelles sont visibles, poursuivre : lorsque les femelles contiennent des œufs, ajouter quelques millilitres d'eau sur la surface des boîtes, agiter doucement les boîtes, puis verser l'eau dans un tube conique de 50 millilitres.

Les nématodes doivent se détacher des boîtes et ne plus être visibles à la surface de la boîte. Laisser les nématodes se déposer au fond du tube, puis prélever l'excès d'eau à la pipette depuis le haut du tube et remplir à nouveau le tube avec de l'eau propre. Après avoir laissé les nématodes adultes se déposer et avoir retiré l'excès d'eau une fois de plus à la pipette, remplir les tubes coniques avec la solution d'œufs.

Ensuite, mélanger les tubes par retournement doux pendant exactement 10 minutes à température ambiante. Après agitation, centrifuger immédiatement les tubes coniques pendant exactement 10 minutes à 1 250 G et à température ambiante, avec le frein activé. Puis décantation rapide du surnageant, resuspension du culot dans la solution d'œufs par pipetage et remplissage du tube conique avec de la solution d'œufs fraîche.

Mélanger soigneusement la suspension d'œufs en retournant le tube trois à cinq fois, puis, immédiatement après, centrifuger les œufs et décanté le surnageant comme vient de l'être montré. Resuspendre le culot dans du milieu misogène, du bouillon ou du LB à l’aide d’une pipette, puis transférer la suspension d’œufs dans un tube conique de 15 millilitres. Remplir maintenant le tube de 15 millilitres avec du LB, laver les œufs trois fois dans le bouillon en utilisant la même technique rapide que celle qui vient d’être démontrée, puis diluer les œufs de P. nematode resuspendus à au moins 10 œufs par microlitre.

Transférez les œufs dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant cinq millilitres de LB et des antibiotiques contre les bactéries colonisatrices. La boîte peut être conservée enveloppée dans du perfil jusqu'à quatre jours après la croissance nocturne et la sélection des bactéries fluorescentes. Utilisez un bâtonnet stérile pour étaler 600 microlitres de la culture bactérienne sur des aérateurs lipidiques de 10 millimètres, puis incubez la culture à 25 degrés Celsius.

Après deux jours, déposer de 500 à 5 000 œufs de nématodes sur chaque plaque lipidique. Si la plaque a été stockée, rincer les œufs dans 15 millilitres de LB comme vient d'être montré, au moins une fois avant d'ensemencer les œufs sur les pelotons bactériens préparés précédemment. Incuber ensuite les cocultures de nématodes et de bactéries à l'obscurité, sans humidité, à 25 degrés Celsius, jusqu'à l'apparition de jeunes infectieux sous forme d'un anneau blanc flou au bord de la plaque.

Lorsque les juvéniles infectieux ont été observés, retirez le couvercle de la boîte de Pétri contenant l'agar lipidique et placez le fond de cette boîte dans le fond d'une autre boîte de Pétri vide de 100 millimètres par 20 millimètres. Ensuite, remplissez la boîte de Pétri avec suffisamment d'eau pour atteindre environ la moitié de la hauteur de la boîte plus petite, puis incubez le piège à eau jusqu'à ce que les juvéniles infectieux descendants soient sortis dans l'eau.

Après avoir collecté les nématodes dans l'eau ou au stade de développement souhaité à partir de la pelouse bactérienne appropriée, dissolvez quelques grains d'ole dans 30 microlitres d'eau, puis ajoutez un à deux microlitres de cet agent paralysant pour chaque 50 microlitres d'échantillon de nématodes. Transférez ensuite environ 20 à 30 microlitres de l'échantillon de nématodes paralysés sur une lame de microscope et placez une lamelle au-dessus de l'échantillon. Observez les nématodes au microscope optique afin de vous assurer qu'ils se trouvent dans le champ de vision.

Pour identifier la localisation bactérienne, photographiez les nématodes en microscopie à fluorescence ainsi qu'en microscopie optique, puis superposez les images. Il peut être nécessaire d'essayer plusieurs grossissements et différents champs de vue du nématode afin de localiser les bactéries.

Une population de nématodes provenant de deux milieux a été comptée et évaluée pour la colonisation par le symbiote bactérien. Pour des statistiques robustes, il est préférable de compter au moins 100 nématodes par échantillon, avec au moins 30 appartenant à chaque catégorie, comme indiqué dans le tableau. Ces nématodes sont colonisés à un niveau d’environ 14,6 % lorsqu’ils sont cultivés sur gélose lipidique et à 68,6 % lorsqu’ils sont cultivés sur gélose au foie et aux reins.

On a observé que d'autres espèces de nématodes et de bactéries présentaient des niveaux de colonisation différents. Ce schéma illustre l'aspect général des femelles Steiner NEMA. L'encart montre l'image en contraste interférentiel différentiel d'une femelle S fot graphic à un grossissement de 20 x.

La flèche noire dans l'encart indique la vulve, tandis que les flèches blanches indiquent les œufs visibles. Cette image montre un œuf de nématode volt développé mais non éclos à un grossissement de 40 x, et ces œufs isolés de nématodes s Volta ont été observés à un grossissement de 10 x. Ici, des images microscopiques représentatives de nématodes Steiner Nima associés à des bactéries Xeno aptus sont présentées dans cette première image.

Les nématodes d'Alvin étaient associés à leur symbiote bactérien exprimant la GFP afin de produire cette image composite. Une image en contraste de phase a été superposée à une image fluorescente. La flèche indique la présence de bactéries à l'intérieur du nématode juvénile infectieux.

Cette image montre un nématode juvénile de S carpa capsi portant des bactéries X nla exprimant la GFP. L'image a été réalisée de manière similaire à l'image précédente et représente le nématode juvénile avec des bactéries marquées par la protéine fluorescente verte, visibles sous forme de bâtonnets verts localisés dans toute la lumière intestinale du nématode. En complément de la procédure décrite, d'autres méthodes, telles que la manipulation génétique du symbiote bactérien avant son association avec l'hôte nématode, peuvent être intégrées afin de répondre à d'autres questions, comme quelles sont les mécanismes moléculaires nécessaires à l'association hôte-microbe.