L'objectif général de cette procédure est d'isoler des vésicules F1 F zéro APAs à partir du cerveau de rat afin d'effectuer des enregistrements en configuration patch clamp. Cela est réalisé en premier lieu en retirant le cerveau d'un rat et en le broyant. La deuxième étape consiste à perturber les zones synaptiques en appliquant une pression.

Ensuite, les synaptosomes sont déposés sur les gradients de flacon. La dernière étape consiste à incuber avec la digitonine et le L pour obtenir les vésicules finales destinées à l'enregistrement en configuration patch. Une fonction importante des mitochondries est la production d'ATP par phosphorylation oxydative.

L'enzyme responsable de la production d'ATP est l'ATP synthase située dans la membrane interne mitochondriale. Pour étudier en détail la fonction de l'ATP synthase, nous isolons des vésicules sous-mitochondriales particulières que nous appelons des VSM. Elles contiennent l'enzyme ATP synthase dans une configuration inversée (lumière vers l'extérieur).

Nous enregistrons ensuite ces PVM à l’aide d’une électrode de micro-patch, et nous déterminons la perméabilité de leur membrane. Cela nous renseigne sur l’efficacité de la production de TP par les mitochondries. Sylvia Ti, chercheuse postdoctorale dans mon laboratoire à l’Université Yale, démontrera cette procédure aujourd’hui.

Dans cette procédure, après avoir obtenu la tête d'un rat par décaptitation, incisez la peau afin d'exposer le crâne, puis ouvrez délicatement le crâne en le coupant avec une paire de ciseaux ou des ciseaux de Rons. Ensuite, retirez le cerveau, hachez le cerveau sans le cervelet finalement isolé, puis placez-le dans un tampon avant de le transférer dans un homogénéisateur en verre et téflon de cinq millilitres. Homogénéisez délicatement le tissu 10 fois, environ cinq minutes au total. Par la suite, centrifugez l'échantillon à 1 500 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table.

Conservez le surnageant contenant les mitochondries et les synaptosomes, et jetez le culot. Ensuite, centrifugez à nouveau à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table. Puis, éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans 500 microlitres de tampon d'isolement. Rompez les synaptosomes à l’aide d’un récipient de disruption cellulaire en appliquant une pression de 1 200 PSI pendant 10 minutes, suivie d’une décompression rapide. Déposez les zones synaptiques rompues sur des tubes de centrifugation contenant deux concentrations différentes de fial, formant ainsi deux couches.

Ensuite, placez les tubes dans un rotor SW 50.1 et centrifugez à 126 500 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Dans une ultracentrifugeuse, le culot correspond aux mitochondries purifiées. La couche située entre les différentes densités du fial est le synaptosome non rompu.

Ensuite, lavez le culot par centrifugation dans le tampon d'isolement à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table. Resuspendez maintenant les mitochondries dans 200 microlitres de tampon d'isolement, combiné à un volume égal de digitonine à 1 %.

Placez-le sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez davantage de tampon d'isolement et centrifugez à 16 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Répétez cette procédure deux fois, puis resuspendez le culot dans 200 microlitres de tampon d'isolement, ajoutez deux microlitres de 10 % SDS, mélangez et placez sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, déposez le mélange en couches dans le tampon d'isolement dans des tubes de centrifugation. Placez les tubes dans un rotor SSW 50.1 et centrifugez à 182 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après une heure.

Lavez la palette finale en la centrifugeant dans du tampon d'isolement à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Un équipement typique d'électrophysiologie comprend un amplificateur, un ordinateur PC équipé d'un Digi Data 1 440, une interface convertisseur analogique-numérique utilisée conjointement avec le logiciel pCLAMP 10.0, un microscope, une table d'isolation vibratoire et une cage de Faraday. Commencez par tirer une pipette à partir d'un capillaire en verre borosilicaté à l’aide d’un tireur de micropipettes Flaming/Brown.

La résistance optimale de la pipette doit se situer entre 80 et 100 mégaohms. Ajoutez les vésicules submitochondriales dans une solution intracellulaire physiologique. Ensuite, remplissez une pipette de patch-clamp avec la même solution.

Visualiser les vésicules en contraste de phase. Microscopie après que les vésicules microsommées soient fixées à température ambiante. Enregistrer l'activité lorsque le potentiel membranaire est maintenu à une tension comprise entre moins 100 millivolts et plus 100 millivolts pendant 10 secondes à chaque période.

Les données enregistrées sont filtrées à cinq kilohertz à l'aide du circuit d'amplification et analysées avec le logiciel ClampFit 10.0. Cette figure montre le transfert de lysat préparé à partir du cytosol et des mitochondries. Le panneau supérieur montre un immunotransfert réalisé à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine cytosolique GA dh.

Le panneau inférieur montre un immunoblot utilisant un anticorps dirigé contre la protéine de la membrane interne mitochondriale. Cox quatre présente deux enregistrements représentatifs par la technique du patch clamp avant et après l'ajout d'une millimolaire d'ATP. Le potentiel de maintien est de 70 millivolts positifs. La ligne en pointillés représente zéro picoampères.

Chaque trace est enregistrée pendant 10 secondes, avec un intervalle de 10 secondes entre les traces. Voici des exemples de tracés illustrant les variations de l'intensité de fluorescence de l'indicateur CMA au cours du temps en présence de VMS, en l'absence et en présence d'une ATP synthase. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement des mitochondries et des vésicules sous-mitochondriales contenant la synthétase F1-FO ATP. De plus, vous devriez comprendre comment former un scellement étanche de type « résistant » à l'aide d'une électrode placée sur la membrane de la vésicule, afin d'analyser l'activité canal du complexe ATP synthase.