D'analyser et de structures d'acides nucléiques avec 3DNA

L'objectif général de cette procédure est de rendre la suite de programmes 3D NA accessible aux scientifiques de laboratoire et à d'autres chercheurs afin d'étudier l'organisation spatiale de l'ADN et de l'ARN à l'aide d'outils informatiques de pointe. Cela s'accomplit en premier lieu en téléchargeant le logiciel depuis le forum 3D NA et en l'installant sur un ordinateur local. La deuxième étape consiste à analyser une structure d'ADN représentative au niveau des pas de paires de bases constitutifs.

Ensuite, la même structure d'ADN est modifiée au niveau des pas de paires de bases, puis reconstruite à l'aide des nouveaux paramètres définis pour les pas de paires de bases. L'étape suivante consiste à analyser un grand ensemble de structures apparentées. La dernière étape est l'alignement d'un ensemble de structures d'ADN apparentées sur un repère commun afin de visualiser les déformations globales des structures.

En fin de compte, les outils 3D NA sont utilisés pour examiner comment chaque pas de paire de bases, y compris ceux liés à des médicaments et des protéines, contribue au repliement global de l'ADN et pour identifier les sites et les directions des déformations globales importantes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la robustesse du logiciel et son applicabilité étendue à diverses structures contenant des acides nucléiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biochimie et en biophysique, telles que la manière dont les génomes sont organisés en trois dimensions, et quel type de déformation l'ADN peut adopter.

Pour commencer l'installation du package logiciel, accédez au site web de DA trois@xthreed.org et cliquez sur le lien vers le forum 3D NA. Dans le forum, sélectionnez le lien d'inscription et suivez les instructions pour créer un nouveau compte.

Une fois le nom d'utilisateur et le mot de passe définis, connectez-vous au forum, sélectionnez le lien de téléchargement dans la section de bienvenue, puis, sur la nouvelle page, choisissez le téléchargement 3D NA. Double-cliquez sur le fichier tar gz pour créer un dossier nommé X 3D NA dash V 2.1, qui contient le logiciel 3D NA. Ouvrez l'application Terminal, généralement située dans Utilitaires sur un Macintosh, puis accédez au répertoire X 3D NA dash V 2.1.

Exécutez le script de configuration nécessaire au bon fonctionnement de la 3D NA. Toutes les commandes utilisées dans cette vidéo sont disponibles dans le protocole textuel. Ensuite, copiez les deux lignes des paramètres d'exportation qui s'affichent à l'écran.

Si l'utilisateur a placé le logiciel dans le répertoire des applications, les deux lignes doivent apparaître comme indiqué ici. Ouvrez l'application d'édition de texte située dans le répertoire des applications. Dans le menu Format, sélectionnez Passer au texte brut.

Si un fichier BRC existe, ouvrez-le dans un éditeur de texte, modifiez-le et collez les paramètres d'exportation à la fin du fichier. Sinon, si aucun fichier bash RC n'existe, collez les paramètres d'exportation dans un fichier vide et enregistrez-le sous le nom bash RC dans le répertoire personnel. Pour que les nouveaux paramètres soient disponibles, exécutez le fichier Bash RC nouvellement enregistré dans le programme terminal.

Ce vidéo montre l'analyse d'une structure représentative d'acide nucléique, l'ADN lié à la protéine HBB provenant de la bactérie Borrelia burgdorferi. La première étape de l'analyse 3D de l'AN consiste à créer un fichier qui répertorie toutes les bases appariées. Cela s'effectue en saisissant une commande pour appliquer le programme Find para à la structure atomique stockée dans le fichier np2, mp2 pdb.

La prochaine étape de l'analyse consiste à déterminer les paramètres géométriques qui caractérisent la structure. La commande analyze prend en entrée le fichier de paires de bases et crée plusieurs fichiers de sortie qui apparaissent dans le répertoire de travail. Les valeurs géométriques peuvent ensuite être calculées en tapant : analyze two MP two bps.

Les fichiers de sortie générés incluent deux fichiers : MP deux out, qui contient un aperçu des paramètres calculés, et bpco step par, qui contient une liste des paramètres de corps rigide. En complément de l'analyse d'une structure d'acide nucléique, le logiciel 3D NA permet de construire un modèle structural à partir des paramètres de corps rigide en utilisant la commande rebuild afin de créer un modèle atomique approximatif, incluant les coordonnées des atomes de l'arrière-plan et des bases. Saisissez la commande indiquée dans le texte. Cette commande indique à 3D NA d'introduire une conformation standard de squelette ADN dans la construction de modèles à partir des paramètres de corps rigide.

Un modèle en double hélice avec les paramètres de corps rigide trouvés dans la structure H-B-B-D-N-A peut ensuite être construit en saisissant la commande appropriée. Le fichier de paramètres par bpco peut être modifié pour générer une structure altérée. Ici, les angles de roulis extrêmes formés aux deux sites de courbure maximale sont modifiés.

La structure est ensuite construite à l'aide du jeu modifié de paramètres d'étape en tant que fichier d'entrée. Les deux modèles peuvent être visualisés à l'aide d'un visualiseur moléculaire standard, contrairement à l'analyse d'une structure contenant un seul acide nucléique. Cette partie de la vidéo montrera comment analyser un grand ensemble de structures dans un ensemble de fichiers, commençant par les noms MD_ensemble_un_PDB et se terminant par un numéro.

La première étape de l'analyse consiste à identifier les bases appariées obtenues en exécutant le programme find pair comme précédemment, puisque l'ensemble des structures partage le même schéma d'appariement de bases ; il suffit donc d'exécuter find pair une fois sur un fichier représentatif ici, le fichier se terminant par 1001. Ceci génère les informations sur l'appariement des bases et les stocke dans le fichier MD at set one BPS PS. L'étape suivante consiste à déterminer les paramètres géométriques de l'ensemble complet des structures à l'aide de la commande X 3D ncore ensemble.Analyze. Ensuite, les paramètres rigides souhaités peuvent être extraits du fichier de synthèse obtenu, MD at set one out.

Cela est effectué à l'aide de l'extrait d'ensemble Command X trois DCO. Les angles de roulis sont extraits et un fichier texte de ces angles, séparés par des virgules, est créé. Ce fichier peut être lu par d'autres programmes pour des analyses et des tracés supplémentaires.

La version la plus récente de 3D NA comporte une nouvelle fonctionnalité permettant à un utilisateur d'examiner plusieurs structures selon une perspective commune. La commande X three DCO ensemble reorient superpose un ensemble de structures apparentées sur une paire de bases ou une étape de paire de bases commune, comme dans les protocoles précédents. La première étape consiste à calculer l'appariement des bases de l'ADN à l'aide du programme find pair.

Dans ce cas, le fichier d'entrée est constitué de deux fichiers pdb KEK contenant les 10 structures de l'opérateur CIA coli, O 3D NA lié à la tête du répresseur LAC. La commande X trois DCO ensemble reorient alignera les modèles individuels d'une structure multi-modèles sur un repère commun. Cette commande nécessite à la fois le fichier PDB et le fichier d'appariement de bases de l'étape précédente en tant qu'entrées.

La commande inclut également l'identité de l'étape de paire de bases par rapport à laquelle toutes les structures sont alignées. L'interface web W 3D NA intègre certaines fonctionnalités populaires du logiciel 3D NA. Cette partie de la vidéo met en évidence la capacité de construire des modèles tridimensionnels d'ADN associé à des protéines à l'aide du serveur web.

La première étape pour construire un modèle d'ADN décoré de protéines consiste à consulter le site web W 3D NA, situé à l'adresse W three d.rutgers.edu. La sélection de la reconstruction dans le menu situé en haut à gauche de la page active les fonctionnalités de création de modèles en ligne. L'étape suivante consiste à choisir le lien vers le modèle d'ADN lié à la protéine, situé dans la zone légèrement ombrée au centre de la nouvelle page.

Cette sélection activera un menu déroulant, qui permet à l'utilisateur de préciser le nombre de protéines liées. La sélection du nombre de protéines liées conduit à une nouvelle page de spécification. L'utilisateur peut alors saisir ou coller la séquence souhaitée.

Dans la zone de texte, au milieu de la nouvelle page, une liste déroulante se trouve sous la zone de texte pour sélectionner la confirmation hélicodale des régions non liées de l'ADN. Une zone de texte située près du bas de la page de spécifications permet d'entrer les positions de liaison et les noms de fichiers des protéines liées. La position de liaison indique l'emplacement du centre du fragment protéique lié sur la séquence d'ADN.

En bas de la page de spécification, une zone permet à l'utilisateur de générer un aperçu de l'ADN lié à la protéine. Dans ce cas, cette case est cochée et le bouton continuer est cliqué. Cette action génère une page de revue listant les paramètres sélectionnés, ainsi que toute erreur pouvant résulter du chevauchement des sites de liaison choisis.

L'utilisateur peut sélectionner le bouton de retour s'il doit apporter des modifications, ou le bouton de création pour continuer. La page suivante affiche une image fixe du complexe ADN-protéine dans sa configuration la plus étendue et permet une visualisation interactive en ligne via le web. L'utilisateur peut également télécharger un fichier contenant les coordonnées atomiques.

Les outils logiciels 3D NA sont couramment utilisés pour analyser les structures des acides nucléiques. Les valeurs des paramètres de corps rigide révèlent des distorsions dans la structure tridimensionnelle, telles que les deux sites de courbure extrême de l'ADN vers le grand sillon, avec de grands angles de roulis positifs observés aux positions 13 et 22. Dans le complexe cristallin d'ADN avec la protéine RHBB de Borrelia Bergdorf.

La capacité du logiciel à reconstruire des structures à partir de ces quantités permet de déterminer comment chaque étape de base et de paire de bases contribue au repliement moléculaire global. Comme illustré ici, la courbure globale de l'ADN induite par HBB reflète davantage que les deux distorsions extrêmes des rôles mentionnées ci-dessus. L'ADN demeure fortement courbé lorsqu'il est reconstruit avec ces étapes de paire de bases redressées.

C’est alors que les deux valeurs les plus élevées du rôle ont été fixées à zéro. La nouvelle fonctionnalité de la 3D NA permettant d’examiner un grand nombre de structures apparentées rend possible l’extraction de motifs dépendant à la fois de la séquence et du temps dans les arrangements spatiaux des molécules d’ADN et d’ARN simulées. Par exemple, la coloration jaune des angles de roulis entre paires de bases successives dans deux grands ensembles de structures d’ADN simulées révèle la flexion préférentielle de ces molécules aux pas de paires de bases puriniques permienne.

Les valeurs plus élevées du roulis, représentées en rouge, qui persistent pendant de courtes périodes aux extrémités de l'ADN, suggèrent une fusion localisée et un recroquevillement de la structure en double hélice. Les profils de variation d'autres paramètres de corps rigide, tels que les angles et les distances entre les bases complémentaires, peuvent aider à décrypter les distorsions structurales précises. La capacité du logiciel 3D NA à réorienter des molécules apparentées dans un repère commun met en évidence des caractéristiques de la structure globale masquées dans de nombreux fichiers stockés dans la base de données des protéines.

Par exemple, l'alignement classique de structures apparentées sur la base d'un ajustement par la racine carrée de la moyenne des carrés des atomes correspondants produit une série de trajectoires spatiales similaires qui se superposent approximativement les unes aux autres ici, les 10 modèles basés sur la RMN de l'opérateur d'ADN O3 d'Escherichia coli lié aux domaines d'extrémité de la protéine répresseur LAC ; la superposition de ces mêmes structures sur un repère de coordonnées commun au niveau de la paire de bases terminale en 5' de chaque duplex révèle des distorsions notables de la structure globale, au sein desquelles les molécules fléchissent dans des directions sensiblement différentes. La variabilité structurale peut influencer la facilité avec laquelle la protéine répresseur LAC d'Escherichia coli se lie à O3 et induit une boucle entre O3 et des opérateurs éloignés en séquence dans l'opéron LAC. Comme illustré ici, le positionnement précis d'une protéine architecturale telle que HBB de Borrelia burgdorferi peut avoir un effet spectaculaire sur le repliement global de l'ADN.

Si deux copies de la structure connue à haute résolution sont séparées par 43 paires de bases, un fragment d'ADN de 81 paires de bases se referme en une configuration serrée, presque circulaire. Si les deux protéines sont séparées par cinq paires de bases supplémentaires, l'ADN suit un trajet ouvert et sinueux. Les arrangements très différents du duplex orné de protéines montrent comment l'espacement des protéines architecturales peut influencer la cyclisation ou la formation de boucles de l'ADN après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale des acides nucléiques pour explorer les interactions ADN-protéine, le repliement de l'ARN et la conception de nanoparticules, afin de mieux comprendre les anomalies du développement et les maladies telles que le cancer, ainsi que de concevoir de nouveaux traitements.