Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l'antigène

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser le test DTH trans vivo pour surveiller à la fois les réponses spécifiques aux antigènes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires chez des sujets humains. Tout d'abord, isoler les cellules mononucléées du sang périphérique à partir du sang périphérique du sujet humain. Ensuite, mélanger la préparation de PBMC avec du PBS.

Antigène de rappel, antigène de test et antigène de test plus antigène de rappel. Effectuez les mesures préliminaires des coussinets plantaires et injectez les mélanges préparés dans des souris. Répétez les mesures des coussinets plantaires 24 heures plus tard. Trois.

Des profils définis de réponses DTH peuvent être régulatrices, non régulatrices ou sensibilisées. Le test de l’hypersensibilité retardée trans vivo peut être utilisé pour déterminer des paramètres cliniques tels que les réponses allo-réactives, où la source de l’antigène est constituée des cellules du donneur de greffe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes in vitro existantes réside dans la possibilité de détecter facilement, à l’aide d’un seul système d’essai, à la fois les réponses pro-inflammatoires et régulatrices dirigées contre des allo-antigènes, des auto-antigènes ou des antigènes tumoraux.

Egon, un chercheur de mon laboratoire, va maintenant démontrer la procédure en utilisant du sang périphérique humain frais recueilli dans des tubes contenant du citrate-dextrose acide afin d'éviter l'activation des plaquettes. Isoler les PBMC à l'aide de milieu de séparation des lymphocytes selon les méthodes standard. Laver la préparation de PBMC avec du PBS pour éliminer les plaquettes contaminantes.

Si une contamination notable par des globules rouges est observée, procéder à la lyse des cellules rouges à l’aide d’un tampon de lyse CK. Effectuer ensuite deux nouveaux lavages avec du PBS Resus. Suspendre les PBMC dans du PBS à une concentration de 10 millions de PBMC par millilitre pour l’antigène allo.

Commencez par les BMC P, isolées à partir du sang périphérique du donneur en utilisant la procédure indiquée précédemment. Ensuite, resus. Suspendez les cellules du donneur dans du PBS à une concentration de 120 millions de cellules par millilitre et ajoutez un micromolaire de PMSF pour prévenir la dégradation des protéines.

Effectuez maintenant la sonication de la suspension cellulaire en utilisant sept impulsions d'une seconde avec un sonde de deux millimètres. À l’aide d’un hémocytomètre, vérifiez la rupture de plus de 90 % des cellules.

Ensuite, centrifuger le mélange à 14 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférer soigneusement le surnageant dans deux tubes à verrouillage sécurisé et déterminer la concentration en protéines par des méthodes standard pour chaque injection. Aliquoter sept fois 10 à la puissance six PBMC dans deux millilitres.

Les tubes Safe Lock pelletent les cellules par centrifugation. Préparez d'abord la suspension témoin négatif des PBMC dans 35 microlitres de PBS. Ensuite, pour le témoin positif, ajoutez 25 microlitres d'un antigène de rappel, toxoïde tétanique, toxoïde diphtérique, et ajustez le volume d'injection à 35 microlitres avec du PBS.

Suivant le plan expérimental pour évaluer la réponse spécifique au donneur, resuspendre le culot cellulaire dans 10 microlitres d'antigène du donneur plus 25 microlitres de PBS, pour un volume total de 35 microlitres. Pour évaluer la régulation spécifique à l'antigène du donneur dans le cadre de l'expérience, resuspendre le culot cellulaire dans 35 microlitres en ajoutant 10 microlitres d'antigène du donneur et 25 microlitres d'antigène de rappel TT DT. Après anesthésie, placer un pied à coulisse à ressort au centre d'une coussinette plantaire chez la souris anesthésiée à l'isoflurane, une extrémité touchant la dernière coussinette de marche du pied, afin d'établir un repère permettant de maintenir constant le site de mesure une fois que la lecture du dispositif est stabilisée.

Enregistrez l'épaisseur initiale de la plante du pied pour l'injection dans la plante du pied. Placez la seringue avec l'aiguille orientée vers les orteils et le biseau vers le haut. Procédez maintenant à des injections sous-cutanées de chaque suspension cellulaire dans les plantes des pieds postérieurs de la souris.

Numéro un, injecter lentement l'empreinte plantaire droite avec la préparation témoin négative. Ensuite, injecter l'empreinte plantaire gauche avec le témoin positif constitué des PBMC plus le TT dt. Ramener ensuite la souris dans sa cage.

Deuxièmement, injecter le coussinet plantaire droit avec des PBMC associés à un antigène allogénique et le coussinet plantaire gauche avec des PBMC associés à un antigène allogénique et au TT dt. S'assurer qu'il n'y a pas de fuite 18 à 24 heures après l'injection. Anesthésier chaque souris à l'isoflurane et répéter la mesure du gonflement du coussinet plantaire.

Soustraire l'épaisseur de chaque patte avant à l'injection de la valeur post-injection afin d'obtenir la valeur d'œdème de la patte. Ensuite, calculer l'œdème net spécifique à l'antigène en soustrayant la valeur d'œdème de la patte témoin des valeurs d'œdème de la patte obtenues après les traitements. Vérifier la lecture du témoin positif en recherchant une réponse du témoin positif à l'antigène de rappel TT DT supérieure ou égale à 25 fois 10 à la puissance moins quatre pouces.

Une réponse de fond au PBS est requise pour que le test soit considéré comme valide. Ensuite, déterminez l'inhibition des réponses de rappel en présence d'antigènes du donneur. Cette expérience évalue les receveurs de greffe rénale pour la réponse spécifique aux antigènes du donneur ainsi que pour la régulation.

Il existe trois profils principaux d'hypersensibilité de type retardé chez les receveurs de greffe : régulateur, non régulateur et sensibilisé. Tous les patients ont réagi fortement au témoin positif constitué de l'antigène de rappel tt. Le patient numéro 62 présente le profil régulateur, caractérisé par une réponse faible à l'antigène donneur et une suppression liée marquée de la réponse à l'antigène de rappel en présence de l'antigène donneur.

Ce schéma est celui qui a été associé à la tolérance aux greffes d'organes allogéniques. Le patient numéro 48 présente un schéma non régulateur, caractérisé par une réponse faible contre le donneur, mais sans suppression liée. Ce schéma est fréquemment observé chez les patients sous traitement immunosuppresseur.

Le patient numéro huit présente le profil de sensibilisation au donneur, caractérisé par une réponse élevée à l'antigène du donneur et l'absence de suppression liée. Cette réponse est associée au rejet de la greffe. Dans des études cliniques de cas, les BMC du donneur provenant de sujets inclus dans un essai observationnel ont été analysés afin d'évaluer la voie indirecte spécifique au donneur, ainsi que les réponses des lymphocytes T effecteurs et régulateurs T, pour déterminer le rôle de la régulation spécifique au donneur dans la tolérance clinique.

Les réponses tectorielles indirectes aux antigènes du donneur révèlent un spectre distinct parmi les groupes inclus. L'augmentation du gonflement de la pulpe augmente au fur et à mesure que l'état clinique du patient évolue de la tolérance vers le rejet chronique. Ici, le test de suppression liée mesure la voie indirecte anti-donneur de la réponse des lymphocytes T régulateurs.

Ces données montrent une diminution des réponses régulatrices dans la gamme allant des patients les plus tolérants aux patients chroniquement rejetant, en passant par les patients intermédiaires. Pris ensemble, la régulation immunitaire mesurée par le test DTH trans vivo semble être un mécanisme important pour l'acceptation du greffon rénal.

Un domaine prometteur est l'application du test TDTH dans la surveillance de l'auto-immunité. Notre étude sur le rôle du collagène de type cinq dans le processus pathologique du syndrome de bronchiolite oblitérante (BOS) a révélé que le risque relatif le plus élevé de développement du BOS était observé chez les patients présentant une réponse positive au collagène. Cinq pbmc provenant de receveurs de greffe pulmonaire, mais pas de témoins sains ou du collagène.

Quatre patients atteints fréquemment du syndrome des bons pasteurs réactifs après une greffe rénale étaient également réactifs au collagène V. Le test TDTH peut également être utilisé pour évaluer la réactivité des PBMC provenant de patients cancéreux vis-à-vis d'antigènes spécifiques aux tumeurs. Par exemple, la présence de cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène PAP chez des patients atteints de cancer de la prostate pourrait limiter la réponse à la vaccination par l'antigène PAP.

Le test DTH TRANSVAAL est un nouveau test diagnostique ayant une application clinique pour l'évaluation des réponses immunitaires à médiation cellulaire chez les patients transplantés, cancéreux et souffrant de maladies auto-immunes. Il est précieux car il permet non seulement de surveiller les réponses de rappel des lymphocytes T effecteurs, mais aussi de détecter les réponses des lymphocytes T régulateurs, puisqu'il ne repose pas sur la mesure d'une cytokine particulière pour identifier les lymphocytes T effecteurs ou régulateurs. Il est très souple et largement applicable.