Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

L’objectif global de cette procédure est de réaliser une technique basée sur la PCR pour quantifier la greffe de cellules de donneur dans un modèle compétitif de greffe de moelle osseuse murine, ceci étant accompli en effectuant d’abord une greffe de moelle osseuse chez des souris receveuses femelles en utilisant des cellules de donneurs mâles. Ensuite, le sang périphérique est prélevé sur des souris receveuses à différents moments et l’ADN génomique est isolé. Les échantillons sont préparés pour une courbe standard.

Enfin, la PCR en temps réel est réalisée avec des échantillons standard et des échantillons de test. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la greffe de cellules dérivées de donneurs mâles chez les souris receveuses femelles par calcul par rapport à une courbe standard avec un pourcentage connu d’ADN mâle par rapport à l’ADN femelle. L’avantage mâle de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la méthode basée sur la cytométrie en flux, est qu’elle est plus sensible, plus économique et que les échantillons peuvent être stockés pendant une longue période.

Plus important encore, notre technique est la plus indépendante de la chaîne et peut être utilisée pour n’importe quel fond génomique de souris, comme un marqueur de surface cellulaire bien défini pour différencier la cellule donneuse des cellules receveuses Après l’euthanasie FVB nj, le donneur mâle et les souris femelles sous une hotte à flux laminaire utilisent de petits ciseaux et des pinces pour disséquer les os du fémur et du tibia et les placer dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres contenant six millilitres de glace RPMI 1640 avec 5 % de chaleur inactivée. FBS utilise une lingette Kim pour enlever les muscles et autres tissus et couper les deux extrémités de chaque tige osseuse dans le plat. Connectez ensuite l’extrémité des os à une aiguille de calibre 23 attachée à une seringue de trois cc remplie de RPMI 1640 avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur et rincez la moelle.

Utilisez la même aiguille pour désagréger le tissu de la moelle osseuse par des aspirations répétées. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et faites-la tourner pendant cinq minutes à 400 G.Après avoir retiré le supernat, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de lyse des globules rouges à température ambiante, tamponnez et incubez à température ambiante pendant cinq minutes avant d’ajouter cinq à 10 millilitres de RPMI 1640 avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur, passez les cellules à travers une crépine cellulaire et collectez le flux dans un nouveau tube. Après avoir fait tourner les cellules pendant cinq minutes à 400 G et retiré le surnageant, la pastille doit être absente de couleur rouge indiquant l’élimination complète des globules rouges remis en suspension dans 10 millilitres de RPMI 1640 avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur après un léger vortex, ajoutez une petite aliquote à un hémocytomètre et comptez les cellules.

Calculer le volume de cellules nécessaires pour se mélanger avec les cellules femelles concurrentes dans un rapport de cinq à deux pour la greffe de moelle osseuse. Comme dernière étape pour préparer les cellules à l’injection, mélangez les cellules du donneur et des cellules concurrentes, granulez les cellules lavées avec du PBS et mettez-les en suspension dans le PBS à une concentration finale de cinq fois 10 à six par millilitre de cellules donneuses et deux fois 10 à six par millilitre pour les cellules concurrentes, quatre à six heures avant la greffe de moelle osseuse. Irradiez des souris receveuses femelles avec un rayonnement gamma de césium 1 37 à une dose unique de 11 grays.

Placez les souris femelles irradiées dans un dispositif de contention de souris et injectez les cellules mixtes du donneur et du compétiteur par la veine de la queue dans un volume total de 0,1 millilitre, de sorte que chaque souris reçoive cinq fois 10 cellules du cinquième donneur et deux fois 10 cellules de moelle osseuse concurrente pour prélever des échantillons de sang. Après anesthésie, les souris collectent environ 50 microlitres de sang dans des tubes recouverts d’EDTA par saignement rétroorbitaire. Prélevez également des échantillons de souris mâles et femelles du même âge.

Ensuite, pour isoler l’ADN génomique des souris et des souris sujets. Pour la courbe standard, ajoutez environ 200 microlitres de tampon de lyse RBC à température ambiante à chaque échantillon de sang et incubez pendant cinq minutes. Ajoutez un millilitre de PBS et tournez vers le bas pour éliminer la plupart des globules rouges lysés.

Ensuite, utilisez un kit d’extraction d’ADN sanguin pour isoler l’ADN avant de réchauffer le tampon elucien à 37 degrés Celsius. Pour améliorer le rendement, mesurez la concentration d’ADN de chaque échantillon. Ceux dont le rapport OD est compris entre 60 et 80 entre 1,8 et 2,0 sont utilisés pour une analyse plus approfondie.

Pour établir une courbe standard, diluez l’ADN mâle et femelle à une concentration de quatre nanogrammes par microlitre et préparez le mélange d’ADN selon ces directives. Configurez la plaque de réaction PCR en mélangeant le réactif cyber green super mix avec les amorces présentées ici et de l’ADN génomique. Chaque réaction de 20 microlitres contient 400 nanomolaires de chaque amorce et cinq microlitres d’ADN génomique de cellule sanguine en trois exemplaires.

Effectuez la PCR selon les conditions trouvées dans le protocole textuel et obtenez le seuil de cycle ou les valeurs CT. Calculez delta CT multiplié par la quantité CT à la puissance ZY, un moins CT à la puissance BCL deux et les niveaux d’expression ZY, ou deux à la puissance moins delta CT, générez des courbes standard en traçant la moyenne du triplicate deux à la puissance delta CT valeurs au pourcentage connu d’ADN mâle dans le mélange avec un ajustement de régression linéaire illustré. Voici des exemples de courbes standard tracées avec des valeurs moyennes de deux à la puissance delta CT en fonction des pourcentages d’ADN mâle.

Ce graphique comprend une température de fusion spécifique pour les amplicons BCL deux et ZFY un localisés à 78,5 et 88,5 degrés Celsius respectivement. BCL deux est utilisé comme gène de référence pour normaliser la quantité totale d’ADN chargé dans chaque réaction PCR. BCL : deux courbes d’amplification pour chaque échantillon standard fusionnent l’une avec l’autre, indépendamment de la concentration d’ADN mâle, indiquant des quantités égales d’ADN chargé.

Cependant, les courbes d’amplification ZFY one ont migré vers la gauche avec des quantités croissantes d’ADN mâle dans l’échantillon de cellules souches hématopoïétiques de souris PIM TKO Les souris ont des défauts de reconstitution des souris létalement irradiées et, comme prévu, les souris receveuses transplantées avec des cellules PIM TKO avaient un pourcentage beaucoup plus faible de cellules mâles par rapport aux souris transplantées avec des cellules de type sauvage. Pour valider notre méthode, nous avons testé la greffe de cellules de donneur mâle chez des souris femelles transplantées, recevant des cellules de moelle osseuse de type sauvage par rapport à des souris PIM triple knockout ou TKO à différents moments après la transplantation, à la fois du sang périphérique à six semaines et des échantillons de moelle osseuse à 16 semaines. Ont été analysés après avoir regardé cette vidéo.

Vous devez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la méthode basée sur la PCR pour quantifier la greffe de cellules du donneur dans un modèle compétitif de greffe de moelle osseuse marine.