Électrotaxie microfluidique à base d'analyse quantitative à la demande de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

L’objectif global de cette procédure est d’identifier des anomalies de la signalisation neuronale et neuromusculaire dans l’organisme modèle de C Allergan à la suite d’une exposition à des produits chimiques ou d’une manipulation génétique. Pour ce faire, il suffit de concevoir et de graver d’abord un motif de microcanaux dans une plaquette de silicium. Au cours de la deuxième étape, le moule en silicone est utilisé pour couler un ou plusieurs micro-canaux à partir de PDMS.

Ensuite, les composants accessoires sont fixés au moule PDMS. Ensuite, le comportement des vers lorsqu’ils sont stimulés à nager à travers le microcanal est enregistré à l’aide d’une caméra montée sur microscope. En fin de compte, l’électromicrofluidique est utilisée pour déterminer les changements dans les nématodes, les systèmes neuronaux et musculaires dus à des manipulations chimiques ou génétiques avec la locomotion comme lecture.

Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes, en particulier les tests comportementaux sur plaque, est qu’avec cette technique, la direction de la locomotion du ver peut être étroitement contrôlée, ce qui permet une quantification précise des comportements locomoteurs tels que la fréquence de flexion du corps, le temps de rotation et la vitesse de nage. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer, car elle peut être utilisée pour dépister les facteurs chimiques et génétiques ayant des propriétés neuroprotectrices. Nous avons eu l’idée de cette technique pour la première fois lorsque nous nous sommes rendu compte qu’il y avait un manque de méthode pour analyser le comportement de mouvement de la méthode de manière quantitative.

Le mouvement est volontaire et aléatoire, et il est difficile à caractériser. Nous avons donc voulu établir une méthode simple que tout le monde peut apprendre : pour fabriquer le moule maître, commencez par baigner une plaquette de silicium de trois pouces dans de l’acétone, puis du méthanol pendant 30 secondes chacune. Rincez ensuite la gaufrette à l’eau déminéralisée pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez une soufflette à azote pour sécher la surface des plaquettes, puis chauffez la plaquette sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius après deux minutes, oxydez au plasma la surface de la plaquette de silicium à 50 watts pendant une minute. Maintenant, à l’aide de trois millilitres de SU eight 100 photoresist, enduisez la surface de la plaquette à 1 750 tr/min pendant 40 secondes, puis précuisez la plaquette enrobée sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius. Après 10 minutes, augmentez la température à 95 degrés Celsius pendant deux minutes et faites cuire la gaufrette pendant une heure supplémentaire.

Après avoir retiré la plaquette de la plaque chauffante, disposez un masque photo du motif souhaité sur la plaquette. Exposez la photorésistance à la lumière UV pendant 95 secondes. Ensuite, post-cuisson de la gaufrette sur une plaque chauffante en utilisant le même gradient de température que celui utilisé pour la précuite après post-cuisson.

Plongez la plaquette dans SU huit. Développez une solution pendant 10 à 15 minutes. Rincez la plaquette avec de l’isopropanol pour confirmer l’achèvement de l’élaboration de la conception.

Rincez ensuite à l’eau déminéralisée pendant 30 secondes. Enfin, séchez la gaufrette avec un pistolet à azote et faites cuire brièvement à 120 degrés Celsius. Maintenant, placez le moule maître fabriqué ainsi qu’une plaquette de silicone vierge dans deux boîtes de Pétri séparées recouvertes de papier d’aluminium.

Versez 20 millilitres de prépolymère PDMS dans le moule et le plat maîtres, et 15 millilitres dans le plat à gaufrettes vierge. Ensuite, appuyez doucement sur les gaufrettes avec un applicateur en bois jetable pour éliminer les poches d’air sous les gaufrettes, puis couvrez les deux plats et laissez-les de côté pendant une journée pour durcir. Une fois les plaquettes durcies, retirez la feuille et décollez le PDMS.

Ensuite, utilisez une licorne Harris de 2,5 millimètres pour perforer les orifices d’accès au fluide aux deux extrémités du canal dans le PDMS à partir du moule maître. Coupez les deux disques PDMS en bandes de taille similaire. Puis dans une salle blanche, chargez le canal, la bande PDMS vierge et une glissière en verre dans un oxydateur plasma.

Exposez les matériaux à un plasma d’oxygène à 40 watts de puissance pendant 40 secondes. Collez ensuite le morceau de canal et la glissière de verre sur les côtés opposés de la bande vierge et mettez les matériaux de côté pour terminer le collage. Après deux heures, utilisez du prépolymère PDMS pour fixer deux morceaux de tube en plastique d’au moins six pouces de long aux réservoirs perforés sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius.

Laissez le PDMS durcir avant de continuer. Fixez ensuite un connecteur en plastique fluidique à l’un des tubes pour permettre la fixation de la seringue. Maintenant, insérez trois longueurs de pouce de fil de cuivre isolé de calibre 22 dans chaque réservoir entre le tube d’entrée et le canal fixant les fils avec plus de prépolymère PDMS.

Commencez cette étape en plaçant le microcanal qui vient d’être assemblé sur une platine mobile XY d’un microscope avec une caméra montée connectée à un moniteur, connectez l’alimentation aux électrodes des microcanaux. Après avoir vérifié que la résistance du microcanal est d’environ 0,6 méga ohms, fixez le tube de sortie du microcanal à une seringue jetable. Ensuite, immergez l’embouchure du tube d’entrée dans une solution de nématodes en suspension dans un tampon physiologique M neuf.

Appliquez une pression négative à l’intérieur de la seringue pour aspirer le liquide dans le canal. Lorsque les tubes d’entrée et de sortie sont tous deux remplis, débranchez la seringue et l’hydrostatique. Manipulez l’écoulement en ajustant la hauteur relative des tubes pour placer une vis sans fin au centre du canal.

Ensuite, posez les deux tubes à plat à la même élévation pour maintenir un débit nul à l’intérieur du microcanal. Lors de la commutation d’échantillons de vers au cours d’une expérience d’électrotaxis, après avoir nivelé les deux tubes d’entrée à la même altitude, s’il y a encore de l’écoulement, effectuez de petits ajustements de la hauteur du tube l’un par rapport à l’autre. Si nous ne sommes jamais sûrs que l’écoulement est vraiment nul, nous pouvons induire une inversion du mouvement du ver en changeant la polarité du champ électrique, puis en évaluant la vitesse linéaire du ver lorsqu’il tourne.

Réglez maintenant l’alimentation sur la tension appropriée. Activez le signal électrique et laissez une minute de pré-exposition pour que le ver s’acclimate au champ, période pendant laquelle le ver devrait commencer à se déplacer vers la cathode lorsque la minute s’est écoulée. Lancez l’enregistrement.

Lorsque l’expérience est terminée, retirez tout le liquide et les vers du canal. Rincez la chambre à l’eau déminéralisée et laissez l’appareil sécher sur une plaque chauffante à 125 degrés Celsius. Dans cette vidéo représentative, un jeune nématode adulte de type sauvage est présenté avec sa position et sa vitesse à partir du logiciel de suivi des vers.

La vidéo commence par la cathode à droite. L’apparence de la pipette en verre indique l’inversion imminente, puis le retrait des signaux de la pipette. Le moment de l’inversion ici, les données pour la position en fonction du temps et la vitesse instantanée en fonction du temps du programme de suivi des vers de terre personnalisé pour le ver Dans la vidéo sont montrés, le programme a calculé la courbe de vitesse à partir de la courbe de temps de position.

Cette boîte à moustaches affiche les données de vitesse électrique d’un ensemble d’animaux de type sauvage et de tranchées. Les animaux transgéniques T expriment le gène alpha-synucléine humaine dans les muscles de la paroi corporelle sous le contrôle du promoteur du gène de la chaîne lourde de la myosine UNC 54, qui provoque l’agrégation des protéines et se manifeste par une réponse électrotactique plus lente que celle des animaux de type sauvage. Une fois maîtrisés, plus de 20 vers peuvent être dosés toutes les heures si l’expérience des électro-taxis est correctement réalisée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que seules les mutations et les produits chimiques affectant la locomotion ou la sensation électroélectrique produiront des phénotypes détectables par le test des électrotaxes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modeler un silicone. Nous avons assemblé le canal microfluidique et la méthode d’analyse de la locomotion de N à l’aide d’un test axxis.