Étude quantitative de la Locomotion librement Piscine Micro-organismes utilisant la diffraction laser

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les fréquences de thrashing d'organismes microscopiques nageant librement. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon de vers microscopiques. Ensuite, le dispositif optique est mis en place.

Ensuite, le motif de diffraction introduit par les organismes vivants est enregistré. Enfin, les données enregistrées sont analysées pour déterminer les fréquences de nage. En définitive, l'analyse de diffraction est utilisée pour montrer les changements dans les schémas de locomotion des vers non contraints.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la microscopie traditionnelle, réside dans la possibilité d'observer les trajectoires de nage alors que l'espèce se déplace librement dans un espace tridimensionnel. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur la nage libre de C. elegans, elle peut également être appliquée à d'autres organismes transparents, petits et microscopiques soumis à des conditions variables. Pour préparer C. elegans en vue d'une analyse vidéo, commencez par utiliser un curet en fil de platine aplati pour transférer 10 à 20 nématodes adultes de souche GR sur un milieu NGM frais.

Plaques de Pétri contenant de l'agar avec de petites taches circulaires d'E. coli. Laisser les nématodes pondre leurs œufs pendant trois à cinq heures, puis retirer les adultes. Ainsi, on établit une petite culture, synchronisée sur le plan du développement, composée de 50 à 150 nématodes. Pour faire croître les nématodes jusqu'au stade de début d'âge adulte, incuber les boîtes de Pétri à 20 degrés Celsius pendant quatre à cinq jours.

Le jour de l'analyse vidéo, utiliser un millilitre d'eau distillée désionisée pour rincer une boîte de nématodes adultes jeunes, afin de recueillir 50 à 150 vers à partir de la culture synchronisée. Utiliser une microcentrifugeuse pour faire déposer les vers au fond du tube ou les laisser sédimenter par gravité pendant environ 15 minutes. Éliminer la majeure partie de l'eau du tube et la remplacer par un millilitre d'eau distillée désionisée afin de laver les bactéries adhérentes aux nématodes.

À l’aide d’une micropipette, transférez cinq à dix nématodes dans de l’eau vers une cuvette en quartz. Montez le dispositif optique comme indiqué ici, en utilisant un laser hélium-néon de 543 nanomètres pour l’échantillonnage excessif, deux miroirs en aluminium à surface frontale utilisés pour diriger le faisceau laser à travers la cuvette, un support de cuvette, un écran de projection et une caméra haute vitesse capable d’enregistrer à environ 240 images par seconde. Ensuite, utilisez un morceau de parafilm pour couvrir le dessus de la cuvette et retournez-la afin de mélanger les nématodes dans la colonne d’eau.

Placer la cuvette dans un support de cuvette de manière à ce que les vers se trouvent initialement près du haut de la cuvette. À l'aide des miroirs, diriger le faisceau laser à travers le centre de la cuvette. Étant donné que les nématodes sont plus denses que l'eau, ils tomberont lentement vers le fond de la cuvette tout en nageant dans la colonne d'eau ; sur l'écran de projection, colorer en noir la tache correspondant au faisceau laser transmis afin de réduire la diffusion lorsque le faisceau transmis atteint l'écran de projection.

Éliminer ou réduire la diffusion du faisceau transmis permettra d'éviter la saturation du réseau CCD de la caméra due au faisceau transmis. Pour obtenir une mesure de la taille du motif de diffraction, tracez une ligne d'environ cinq centimètres sur l'écran de projection à côté du spot du faisceau laser transmis, sans perturber l'image de la lumière diffractée. Éteignez la lumière de la pièce et enregistrez les images de diffraction sur l'écran lorsque les vers traversent le faisceau laser.

Pour préparer les données vidéo, installez le programme d'analyse vidéo suivant et importez la vidéo dans le logiciel. Réglez l'origine de manière à ce qu'elle coïncide avec le point laser transmis à l'aide du logiciel. Suivez le déplacement angulaire de l'image de diffraction formée par chaque nématode.

Copiez et collez les données dans un tableur et ajoutez 180 degrés ou PI à tous les angles négatifs afin d'obtenir un graphique continu. À l’aide du dispositif d’analyse vidéo, placez une photodiode de petite surface légèrement décentrée dans le motif de diffraction, directement devant l’écran de projection, via un port USB.

Connectez la photodiode à l'oscilloscope numérique relié à l'ordinateur. Observez les motifs de battements à l'écran de l'ordinateur. Enregistrez les jeux de données au format ASCI ou texte pour analyser les données.

Utilisez la vidéo ou la photo pour importer les données dans un programme d'analyse de données capable d'ajuster des formes d'onde. À l'aide de la minimisation du khi-deux, ajustez une courbe sinusoïdale afin de déterminer la fréquence d'agitation. Faites la moyenne des fréquences de nage provenant de différents échantillons et déterminez la variance.

Pour cette étude, les données ont été analysées statistiquement à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (Inova), suivie du test de Bonferroni. Le test de comparaisons multiples considère une valeur P inférieure à 0,05 comme statistiquement significative pour modéliser les figures de diffraction. Commencez par utiliser un microscope afin de prendre des images pour analyser une image.

Faites-le glisser dans Mathematica. Utilisez la commande « binary eyes » pour le convertir en noir et blanc. Sinon, utilisez la commande « edge detect » pour créer une image en noir et blanc, où les deux derniers nombres contrôlent la granularité des bords obtenus.

Ensuite, à l'aide de la commande image data, convertir l'image en une matrice de zéros et de uns. Utiliser la commande forer pour transformer la matrice, puis élever au carré la valeur absolue de la matrice, et visualiser l'image résultante, qui correspond au motif de diffraction associé à l'image d'origine. De plus, utiliser la fonction logarithmique pour ajuster le contraste de l'image.

Enfin, comparer les figures de diffraction modélisées avec les figures de diffraction obtenues à partir de vers nageant librement. Dans cet exemple, des *Caenorhabditis elegans* ont été étudiés dans une cuve en quartz Q d'un centimètre de large, de cinq millimètres d'épaisseur et de quatre centimètres de hauteur. Échantillonnage d'un unique ver à l'aide d'une analyse vidéo.

La fréquence moyenne de nage obtenue à partir de l'analyse vidéo dans un milieu d'une épaisseur de cinq millimètres était d'environ 2,5 hertz. De même, l'échantillonnage d'un unique ver à l'aide de la méthode d'acquisition de données en temps réel et d'un oscilloscope numérique a donné une fréquence de nage d'environ 2,7 hertz. Cette procédure peut être répétée sur de nombreux vers.

Une étude détaillée de vers nageant librement a révélé une fréquence moyenne de nage de 2,37 hertz dans un milieu de cinq millimètres. Comme prévu, la fréquence de nage est plus élevée que celle d'un ver rampant. Grâce à cette méthode de diffraction, on a constaté que la fréquence moyenne de nage d'un *Caenorhabditis elegans*, confiné sur une lame de microscope, correspond à la valeur publiée précédemment de deux hertz.

Après avoir visionné la vidéo. La préparation des données et la modélisation des figures de diffraction présentées dans cette vidéo permettent de modéliser les figures de diffraction en nage. À l'aide d'images de vers obtenues avec un microscope conventionnel, les figures de diffraction modélisées sont utilisées pour simuler un cycle de nage de l'élégance marine.

Un modèle réussi repose sur la faisabilité physique des motifs de nage, correspondant aux fréquences de nage. Le ver doit présenter la même forme à la fin du cycle de nage qu’au début de ce cycle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une minute pour chaque ver à l’aide du régime alimentaire photo-rapide, tout en observant les cycles de nage sur l’écran d’ordinateur.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer les nématodes nageant librement.