Détermination de l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

L’objectif global de la procédure suivante est de tester rapidement l’activité des enzymes extracellulaires microbiennes dans une variété d’environnements naturels. Ceci est réalisé en ajoutant des échantillons de boues d’eau ou de sol à la microplaque pour obtenir une réplication adéquate. Dans un deuxième temps, un substrat colormétrique artificiel ou fluorométrique est ajouté aux puits de microplaques, ce qui permet aux réactions enzymatiques de se produire. Ensuite, l’absorbence ou la fluorescence est mesurée afin de déterminer la quantité de produit final libérée au cours de la réaction.

Les résultats montrent des différences dans l’activité enzymatique extracellulaire entre les échantillons en fonction de l’absorbence ou de la fluorescence de la réaction finale. Aujourd’hui, nous allons montrer comment mesurer l’activité des enzymes extracellulaires dans des environnements naturels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne, telles que les taux d’eau du traitement de la matière organique et la minéralisation des nutriments dans les sols, les sédiments et les eaux. En général, les personnes qui débutent dans l’utilisation de cette méthode auront du mal à séparer les particules de la solution réactionnelle, en particulier lors de l’analyse d’un grand nombre d’échantillons.

Une démonstration visuelle de cette procédure est essentielle car une disposition de plaque peut être difficile à apprendre et la prise de mesures à plusieurs pas de temps peut rendre cette procédure plus difficile. L’analyse métrique cholique de l’activité enzymatique extracellulaire pour les sols et les sédiments commence par la préparation du tampon de substrat et des solutions étalons comme décrit dans le protocole textuel pour le sol, préparer une suspension de chaque échantillon à doser dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres. Ajouter une concentration d’environ un gramme par millilitre en utilisant un tampon d’acétate de 50 millimolaires pour les sédiments.

Ajoutez suffisamment de tampon d’acétate pour que la boue soit facilement canalisée. Le volume exact de boue nécessaire variera en fonction du nombre d’enzymes dosées, mais un minimum de cinq millilitres est recommandé. Vortex chaque boue jusqu’à ce que toutes les mottes de sol ou de sédiments se soient dispersées.

Et notez le dernier volume. Coupez l’extrémité des pointes de pipette avec des ciseaux avant de pipeter. Comme les boues de sol ont tendance à obstruer les pointes, revortex chaque boue et pipetez immédiatement 150 microlitres dans chacun des six puits.

Sur un bloc de puits de 96 puits de profondeur. Il est important de vortex à fond et fréquemment. Afin de maintenir les particules de sol en suspension, laissez au moins deux puits par bloc vides pour servir de contrôle du substrat.

Préparer 1 96. Bloc de puits pour chaque enzyme à doser. Versez environ cinq millilitres de tampon en acétate dans un réservoir de pipette et utilisez une pipette à huit canaux pour ajouter 150 microlitres de tampon dans les deux derniers puits de chaque échantillon.

Pour les contrôles du tampon d’échantillon et vers les deux puits de contrôle du substrat. Versez environ 10 millilitres de la solution de substrat de p, de nitro-fenouil ou de PNP appropriée dans un réservoir de pipette et utilisez une pipette à huit canaux pour ajouter 150 microlitres de la solution de substrat aux quatre premiers puits de chaque échantillon et aux deux puits de contrôle du substrat. Notez le moment où la réaction commence, dès que la solution de substrat est ajoutée.

Incuber les assiettes à température ambiante pendant 0,5 à quatre heures. Le temps d’incubation exact variera en fonction du niveau d’activité des échantillons et de l’enzyme à doser. Pendant l’incubation des dosages, préparez une microplaque transparente de 96 puits.

Pour chaque bloc de puits profond, pour lire la pipette d’absorbance, 190 microlitres d’eau distillée et 10 microlitres d’hydroxyde de sodium molaire dans chaque puits de la microplaque. L’hydroxyde de sodium ralentit la réaction enzymatique et augmente le pH, ce qui améliore la couleur du PNP libéré lors de la réaction après l’incubation. Centrifugez les blocs de 96 puits à 2000 à 5 000 fois G pendant cinq minutes pour granuler les particules de sol.

Retirer le liquide sans perturber le granulé peut être un défi. Il faut éviter d’utiliser trop d’échantillon de sol au départ. Assurez-vous de centrifuger suffisamment longtemps et d’utiliser un mouvement prudent mais confiant pour retirer le liquide.

À l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 100 microlitres de chaque. Bien en faisant attention à éviter le granulé. Transférez le liquide dans le puits correspondant sur une microplaque claire de 96 puits préparée, allumez le lecteur de microplaques et configurez tout l’absorbance d’enregistrement logiciel nécessaire à 410 nanomètres après la détermination de la masse sèche des échantillons comme décrit dans le protocole de texte, calculez l’absorbance finale de chaque échantillon en soustrayant l’absorbance de contrôle de l’échantillon de l’absorbance de l’essai d’essai.

Si les témoins du substrat ont une absorbance élevée supérieure à 0,060, soustrayez-les. Procédez également au calcul de l’activité enzymatique en micromoles par heure et par gramme de masse sèche à l’aide de cette équation. Après avoir organisé une microplaque noire pour chaque enzyme en suivant l’exemple montré dans le protocole textuel, versez environ cinq millilitres du premier échantillon d’eau dans un réservoir de pipette et utilisez une pipette à huit canaux pour pipeter 200 microlitres dans tous les puits.

Dans la première colonne de la microplaque, jetez les pointes de pipette usagées et répétez l’opération au besoin pour chaque échantillon d’eau afin de remplir les colonnes un à neuf. Mettre en place des contrôles pour tenir compte des échantillons, des étalons, du substrat et de la trempe sur la même microplaque noire que les échantillons. Les témoins d’échantillon contiennent de l’eau d’échantillon et un tampon de bicarbonate et ne sont pas utilisés dans les calculs d’activité, mais démontreront une cohérence de lecture tout au long de l’expérience.

Les contrôles d’extinction se composent d’un échantillon d’eau et d’une quantité standard de l’étiquette fluorescente et sont utilisés pour mesurer la diffraction de la fluorescence. Dans l’échantillon d’eau, le substrat et les témoins standard sont constitués soit d’un substrat, soit d’une étiquette fluorescente standard et d’un tampon bicarbonate. Versez environ cinq millilitres de tampon de bicarbonate de cinq millimolaires dans un réservoir de pipette propre.

Pipeter 50 microlitres de tampon dans les puits de microplaques un à neuf des rangées d et e pour en former deux, répliquer les puits de contrôles d’échantillon par changement d’échantillon pointes de pipette, puis transférer 200 microlitres de tampon de bicarbonate dans les puits 10 à 12 des rangées A et H.Bien que la lumière soit maintenue brillante dans cette démonstration à des fins de tournage, L’éclairage ambiant doit être réduit en atténuant ou en éteignant les lumières, car la norme fluorescente est sensible à la lumière. Versez environ cinq millilitres de 10 micromolaires, quatre méthylmones ou MUB dans un réservoir de pipette propre, pipetez 50 microlitres dans des puits de microplaques un à 12 dans la rangée H. Ensuite, pipetez 50 microlitres dans des puits de un à neuf dans les rangées G et F pour former trois répétitions de contrôles d’extinction par échantillon et de contrôles standard globaux. Placez la microplaque dans l’obscurité ou couvrez-la d’un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB, allumez le fluorimètre et configurez tout logiciel nécessaire pour être prêt à lire avant d’ajouter le substrat.

Pour environ cinq millilitres du substrat approprié revêtu de MUB dans un réservoir de pipette propre, utilisez une pipette à 12 canaux pour pipeter 50 microlitres dans des puits de microplaques un à 12 dans la rangée A et dans des puits un à neuf dans les rangées B et C pour former trois, répétez les tests pour chaque échantillon et trois contrôles de substrat procédez immédiatement à l’enregistrement de la fluorescence. Lire la fluorescence initiale immédiatement après l’ajout du substrat dans la microplaque après la lecture. La fluorescence incube la microplaque à température ambiante, soit dans l’obscurité, soit recouverte d’un couvercle opaque.

Pour réduire la dégradation par la lumière des MUB. Le temps d’incubation nécessaire pour mesurer l’activité enzymatique potentielle maximale dépendra de la concentration enzymatique dans un échantillon. Comme cela n’est pas connu, avant que l’échantillon ne soit analysé, une microplaque devra être lue à plusieurs pas de temps.

Pour la plupart des enzymes, des intervalles de 10 à 15 minutes au cours d’une heure sont appropriés, bien que certains échantillons à forte concentration atteignent leur maximum avant 10 minutes. Continuer la lecture de fluorescence dans la microplaque aux intervalles indiqués pendant au moins une heure. Assurez-vous de garder la microplaque couverte ou dans l’obscurité entre les lectures.

Pour chaque échantillon, à chaque intervalle de temps, calculer la fluorescence initiale moyenne de l’échantillon, la fluorescence finale moyenne de l’échantillon, la fluorescence standard moyenne et la fluorescence de contrôle d’atténuation moyenne pour chaque intervalle de temps. Calculer l’activité enzymatique en m par heure et par millilitre. En utilisant l’équation trouvée dans le protocole texte.

Examinez les valeurs d’activité calculées pour chaque pas de temps, déterminez l’activité potentielle finale à partir de l’intervalle de temps avec l’activité la plus élevée. Si les valeurs d’activité continuent d’augmenter, des intervalles de temps ultérieurs peuvent être nécessaires. Si les valeurs d’activité baissent tout au long de l’exécution, exécutez à nouveau avec des pas de temps plus courts.

Les sols et les sédiments aquatiques ont généralement des niveaux appréciables d’activité extracellulaire en enzyme en raison des communautés microbiennes attachées qui se développent à la surface des particules. Cette figure montre comment cette activité change en fonction de la taille des particules obtenues à partir des sédiments de surface d’un cours d’eau de troisième ordre dans le nord du Mississippi. Une étude antérieure de l’USAA a montré que les communautés bactériennes sur les particules de sédiments de ce flux peuvent être séparées en trois groupes distincts sur la base de l’analyse moléculaire de leur structure de communauté.

Ceux sur des particules de 0,063 millimètre, ceux sur des particules de 0,1, 2, 5, 0, 0, 25 et 0,5 millimètres, et ceux sur des particules d’un millimètre. L’analyse des modèles d’activité enzymatique extracellulaire soutient cette conclusion, la phosphatase étant similaire sur les particules de 0,1, 2, 5, 0, 0,25 et 0,5 millimètre, mais beaucoup plus élevée sur les fractions d’un et de 0,063 millimètre lorsqu’elle est mesurée à l’aide de la technique du substrat lié au PNP. D’autres enzymes, telles que le bêta-glucco et les n AGA, présentent des pics similaires sur les particules les plus fines, mais ne sont pas élevés sur les particules d’un millimètre.

Soulignant le fait que différentes enzymes peuvent présenter des distributions environnementales différentes et que celles-ci peuvent être élucidées à l’aide de ce test. Les barres d’erreur relativement faibles montrent que les dosages chométriques de l’activité enzymatique sur les sédiments sont reproductibles et se prêtent donc à l’analyse statistique. Lorsque l’on compare des échantillons différents et environnementaux, les eaux naturelles ont tendance à avoir une activité enzymatique extracellulaire par millilitre plus faible que les sols ou les sédiments par gramme.

En tant que tels, ils doivent être analysés de manière métrique à l’aide de substrats liés à MUB. Cette figure montre comment l’activité des enzymes, phosphatase, bêta, glucco et NGA, varie avec la profondeur. Dans un lac peu profond du nord du Mississippi, aux États-Unis, le lac est connu pour être pauvre en nutriments, ce qui est également suggéré par l’activité relativement élevée de la phosphatase et de l’enzyme que les micro-organismes produisent afin d’acquérir du phosphate à partir de composés organiques.

Pour les trois enzymes, les échantillons d’analyse collectés à la surface de l’eau et à 50 centimètres de profondeur ont montré une activité similaire. Alors que l’activité était élevée dans l’échantillon de 100 centimètres, l’échantillon a été essentiellement prélevé à l’interface eau-sédiment et la présence de particules de sédiments dans l’échantillon explique probablement l’activité plus élevée observée dans l’échantillon, en particulier pour le bêta-glucco et les n AGA. Comme pour les substrats PNP, les faibles barres d’erreur montrent que même avec seulement trois lectures répétées, la reproductibilité des tests fluorométriques utilisant des substrats MUB est élevée.

Notez que les unités pour l’activité enzymatique de l’échantillon d’eau sont inalles du substrat consommé, tandis que celles pour l’activité enzymatique sur les particules de sédiments sont en micromoles de substrat consommé, même si la taille par unité est comparable. Cela met en évidence le fait que les sols et les sédiments ont tendance à avoir une activité extracellulaire beaucoup plus élevée que les eaux naturelles. Il démontre également la sensibilité accrue de la technique du substrat lié à MUB et la nécessité d’utiliser cette technique pour doser l’activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons d’eau une fois maîtrisée.

Cette technique peut être utilisée pour analyser neuf échantillons d’eau jusqu’à des enzymes en un peu plus d’une heure tout en essayant cette procédure pour les sols et les sédiments. Il est important d’utiliser un matériau massif connu afin que l’activité puisse être exprimée sur la base du poids sec. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’activité des enzymes extracellulaires et une variété d’environnements naturels en utilisant des techniques métriques de couleur ou de métrique inférieure.