Génération de cisaillement d'adhésion Carte Utilisation SynVivo réseaux microvasculaires synthétique

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir une carte d’adhésion pure de l’adhésion des particules cellulaires à partir d’une seule expérience utilisant des réseaux microvasculaires synthétiques. Ceci est réalisé en enrobant d’abord le dispositif microfluidique avec la protéine d’intérêt, dans ce cas, l’avadon. Dans un deuxième temps, des particules biotinylées sont injectées dans le dispositif à des taux de cisaillement physiologiques, qui se lient au dispositif revêtu d’avadon avec des motifs différentiels en fonction des taux de cisaillement locaux.

Ensuite, le nombre de particules liées est compté afin de générer une carte d’adhésion pure des particules à l’aide d’une base de données créée par calcul des valeurs de vitesse pure dans le réseau. Les résultats montrent qu’il est possible d’obtenir une carte d’adhérence pure à partir d’une seule expérience, ce qui permet de réaliser des économies significatives de temps et de réactifs par rapport aux chambres d’écoulement à plaques parallèles conventionnelles. Le principal avantage de cette technologie par rapport aux méthodes existantes, telles que les canaux d’écoulement linéaires, est que nous pouvons générer des cartes partagées à partir d’une seule expérience, ce qui permet de réaliser des économies significatives en termes d’argent et de temps.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’administration de médicaments, telles que la capacité des véhicules d’administration de médicaments à se lier aux cibles souhaitées. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous utilisions des chambres d’écoulement à plaques de palettes pour comprendre une lésion cellulaire particulière. Dans des conditions fluides, cependant, l’objectif de ce test est de fournir des informations de base sur l’adhésion des particules et des cellules.

La plateforme syn vivo peut être appliquée à une variété d’autres systèmes tels que le cancer et l’administration du SNC, les infections et l’inflammation, la thrombose et le dysfonctionnement de la microcirculation. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes du dispositif microfluidique sont difficiles à apprendre, s’habituer à de petits volumes d’échantillons, et les meilleures pratiques pour éviter la formation de bulles sont mieux communiquées visuellement. Ashley Smith, une chercheuse scientifique de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Le dispositif microfluidique SynVivo SMN est composé de deux ensembles de ports parallèles, l’un pour l’écoulement du revêtement de surface, des fractions et/ou des cellules pour l’installation, et l’autre pour l’exécution du test. Pour commencer, immergez complètement l’appareil dans une boîte de Pétri contenant de l’eau déminéralisée stérile et placez la boîte dans le vide. Dessécher permet au dessiccation de fonctionner jusqu’à ce que tout l’air soit éliminé des canaux de l’appareil.

Cela devrait prendre environ 15 minutes avant de retirer l’appareil de l’eau. À l’aide d’une pince à pointe fine, placez un tube tigon enduit d’eau dans chaque orifice de l’appareil. Le tube doit mesurer environ un pouce de longueur.

L’appareil peut maintenant être retiré de l’eau à l’aide d’une pipette ou d’une seringue. Placez une goutte d’eau autour de la base d’un tube d’orifice d’entrée. Retirez délicatement le tube.

La goutte d’eau empêchera l’air de pénétrer dans l’appareil. Ensuite, préparez une seringue d’un millilitre chargée d’avadon à une concentration de 20 microgrammes par millilitre. Connectez la seringue à une aiguille et un tube en acier inoxydable de calibre 24 Clamp, l’orifice d’entrée n’étant pas utilisé avec une pince à mâchoire.

Insérez le tube dans l’orifice d’entrée de l’appareil. Injecter avadon à un débit d’un microlitre par minute pendant 10 minutes pour permettre une perfusion complète de l’appareil. À la fin du temps d’écoulement.

Serrez tous les tubes avec des pinces à mâchoires et placez l’appareil à quatre degrés pendant la nuit. Laissez l’appareil revenir à température ambiante. Placez ensuite l’appareil sur un microscope à fluorescence inversée équipé d’une platine motorisée et d’une caméra haute performance.

Préparez une solution de deux particules biotinylées au micron à une concentration de 5 millions de particules par millilitre dans un tampon phosphate, une solution saline ou PBS. Chargez les particules dans une seringue d’un millilitre. Préparez une deuxième seringue d’un millilitre de PBS.

Chargez uniquement chaque seringue sur un pousse-seringue, puis connectez-les à l’aiguille et au tube à l’aide d’une seringue pipette. Placez une goutte d’eau autour de la base du tube de l’orifice d’entrée et retirez délicatement le tube utilisé pour recouvrir l’appareil. Insérez soigneusement le tube pour les particules biotinylées et pour le PBS dans chacun des orifices d’entrée.

Commencez ensuite à injecter des particules biotinylées à un débit de 2,5 microlitres par minute. Surveillez l’orifice d’entrée du microscope dès les premiers signes de particules. Démarrez la minuterie et continuez le flux pendant trois minutes.

À la fin des trois minutes, arrêtez le flux de particules biotinylées tout en démarrant simultanément le flux de PBS à un débit de 2,5 microlitres par minute. Laissez le PBS s’écouler dans l’appareil pendant trois minutes pour éliminer les particules non liées. Pour commencer l’acquisition, utilisez la fonction de balayage d’une grande image dans le logiciel d’imagerie pour acquérir l’image de l’ensemble de l’appareil, puis numérotez séquentiellement les bifurcations dans l’appareil et créez une zone d’intérêt circulaire avec deux fois le diamètre des canaux.

Dans ce cas, réglez le diamètre de la zone d’intérêt sur 200 microns puisque le diamètre du canal est de 100 microns. Utilisez la fonction de comptage automatique du logiciel d’imagerie pour exporter le nombre de particules dans chaque zone d’intérêt vers une feuille de calcul. De même, utilisez la fonction de compte automatisé pour exporter le nombre de particules dans l’ensemble de l’appareil.

Des simulations CFD sont exécutées et les résultats sont stockés dans une base de données pour une analyse plus approfondie. Les informations incluses dans les résultats contiennent les taux de cisaillement de la paroi, la vitesse, le flux de particules et l’adhérence au dispositif. Les informations utilisées ici sont utilisées pour déterminer le nombre de particules qui adhèrent à chaque zone d’intérêt à partir d’une entrée définie d’une concentration de particules.

Pour générer une carte d’adhérence par cisaillement, calculez le pourcentage d’adhérence tel que détaillé dans le protocole textuel comme étape finale. Tracez la carte d’adhérence pure en utilisant le taux de pure à chaque bifurcation des réseaux et les valeurs de pourcentage d’adhésion. Cette image montre un dispositif syn vivo SMN à revêtement avidan typique après liaison de deux particules biotinylées microniques.

Notez que les particules adhèrent préférentiellement près des bifurcations du réseau. Les bifurcations numérotées dans le réseau syn vivo SMN peuvent être vues ici. Cette image est l’exemple de carte de cisaillement de la paroi générée par le modèle CFD de l’appareil.

Le taux de cisaillement varie dans le dispositif, allant de 250 secondes inverses à 15 secondes inverses, comme observé dans le système microvasculaire in vivo. Notez que ces taux de cisaillement variables ne peuvent pas être obtenus simultanément dans les canaux microfluidiques linéaires car ils fournissent un taux de cisaillement constant pour chaque débit. Le graphique montré ici des valeurs du taux de cisaillement à chacune des bifurcations du réseau révèle que les modèles de taux de cisaillement sont complexes et ne peuvent pas être obtenus avec une relation analytique simple, contrairement aux canaux d’écoulement linéaires.

De plus, plusieurs bifurcations sont présentes dans le réseau qui tombent dans le même bac. Ajoutant à la confiance statistique des données présentées. Voici des exemples de résultats de l’analyse CFD pour les flux de particules dans le réseau, qui sont utilisés pour calculer les flux de particules dans les branches et les bifurcations du réseau expérimental.

La carte d’adhésion pure calculée à partir d’une seule expérience SMN syn vivo suit la relation inverse observée à partir de cartes d’adhésion pure obtenues à partir d’expériences de canal linéaire. Cependant, à l’aide d’un test SynVivo, une seule expérience permet de générer cette carte pure, tandis que plusieurs séries expérimentales sont acquises à partir des canaux linéaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les périphériques SynVivo SMN pour générer l’adhésion partagée à partir d’une seule expérience.

Lors de la réalisation de cette expérience, il est important de ne pas rappeler de ne pas introduire de bulles dans le dispositif microfluidique SynVivo SMN après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’inflammation pour étudier l’interaction de l’endothélium leucocytaire à différents taux en une seule expérience. Dans la prochaine génération de dispositifs, les chercheurs peuvent étudier l’adhésion et la migration du roulement des leucocytes en un seul essai, ce qui n’est pas possible actuellement.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes d’étude de l’adhésion des médicaments, des véhicules d’administration de médicaments et des cellules peuvent être appliquées pour étudier des questions telles que l’effet physiologique de l’écoulement sur l’adhésion des cellules cellulaires, des médicaments cellulaires et des véhicules médicamenteux.