Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines impliquées dans les complexes protéiques végétaux d’abord exprimées de manière transitoire ou stable dans les plana, les marqueurs de protéines d’intérêt. Ensuite, extrayez les protéines totales des tissus de la plante, et immunoprécipitez la protéine d’intérêt. Ensuite, séparez les protéines immunoprécipitées sur un gel d’acrylamide et extrayez et digérez les protéines de la bande de gel d’intérêt.

Soumettez maintenant les échantillons de protéines pour la spectrométrie de masse. En fin de compte, les résultats de la spectrométrie de masse peuvent détecter des changements dynamiques dans les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation. Contrairement aux méthodes alternatives telles que l’incubation in vitro de kinase avec substrat, cette méthode exprime des protéines dans un planteur.

Vous n’avez donc pas besoin de savoir quelle kinase est responsable de la phosphorylation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que la façon dont les signaux sont transduits en réponse au stress, aux changements environnementaux ou à la reconnaissance des agents pathogènes. En plus de l’identification de la phosphorylation, sites de complexes protéiques de résistance activés, cette méthode peut être largement appliquée à toute modification post-traductionnelle de tout complexe protéique végétal.

En général, les personnes qui découvrent cette méthode auront du mal car elles ne sont pas habituées à travailler avec une grande quantité d’extrait et à effectuer plus d’étapes du protocole en une seule journée. Pour une expression transitoire, faire pousser les souches d’agrobacterium tohin jusqu’à la phase stationnaire. Récoltez les agrobactéries par centrifugation à 3000 Gs pendant cinq minutes.

Remettre en suspension les granulés et le tampon d’infiltration. Tampon. Maintenant, s’infiltre. Des plantes de hamana NCOA de quatre semaines avec des agrobactéries manuellement à l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre ou sous vide avec 0,02 % de tensioactif, deux à cinq jours après l’infiltration.

Récoltez les feuilles infiltrées, congelez-les dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, broie 20 grammes de tissu végétal et d’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon à 80 millilitres de tampon froid C pour 20 grammes. Bien mélanger et décongeler sur de la glace.

Maintenant, homogénéisez avec trois rafales de 10 secondes chacune à pleine vitesse. Filtrer l’homogénat et centrifuger à 30 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant ce temps à 100 microlitres de matrice d’affinité appropriée à 500 microlitres de tampon de blocage du froid D pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et lavé trois fois avec un millilitre de tampon froid D.Ensuite, retirez le supernat de l’extrait de feuille et passez-le dans une seringue de 0,45 micromètre.

Filtrez dans un nouveau tube sur de la glace. Aliquote l’extrait brut. Pour un immuno-blot.

Ajoutez cinq tampons de chargement de page XSDS, un vortex et faites bouillir les échantillons pour les dénaturer. Ajouter 50 microlitres de la matrice d’affinité, suspendus dans le tampon D dans chaque tube. Incuber avec une rotation douce pendant deux heures à quatre degrés Celsius, centrifuger pour granuler la matrice d’affinité.

Prélevez ensuite une aliquote de l’extrait non lié pour un immuno-blot. Jetez le reste du sain, en laissant environ 500 microlitres au fond du tube. Remettez en suspension la solution de lisier à l’aide d’une pointe à alésage large.

Regrouper la solution de boue mélangée des deux tubes dans un seul tube de 1,5 millilitre. Pulsez trois fois pendant cinq secondes à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pour précipiter la matrice d’affinité et retirez le supernat après trois à cinq lavages avec un millilitre de tampon froid D. Retirez l’excès de tampon D avec une aiguille de seringue éluez avec 200 microlitres du tampon d’élution approprié en secouant constamment. Tirez les trois IET dans un seul tube.

Concentrez ensuite les protéines en utilisant 30 microlitres de résine d’absorption vortex. Restons debout pendant cinq minutes et précipitons la résine, jetons le supernat. Ajoutez 50 microlitres d’un tampon de chargement de page XSDS à la matrice d’affinité précipitée ou au vortex de résine d’absorption et faites bouillir pendant 10 minutes à 80 à 100 degrés Celsius dans une centrifugeuse à bloc de chaleur.

La matrice d’affinité bouillie est résine pendant deux minutes à 10 000. GS aliquote cinq microlitres du supernat pour l’immuno-bloc et l’exécution avec d’autres fractions sur une page SDS de 10 centimètres de long. Gel pour la séparation et l’identification de protéines phosphorylées par spectrométrie de masse.

Chargez les 45 microlitres restants sur une coloration gel de page FDS. La page SDS gel avec un bleu brillant colloïdal kamasi. Conservez ensuite le gel avec un lavage abondant et de l’eau, de préférence toute la nuit.

Maintenant, avec un scalpel propre, excisez la bande d’intérêt du gel, coupez la tranche de gel en cubes de deux à quatre millimètres et transférez l’échantillon dans un tube. Lavez les morceaux de gel avec 50 % d’acéto nitrile et 50 millimolaires de bicarbonate d’ammonium jusqu’à ce qu’ils soient tachés. Ensuite, pipetez la solution.

En prenant soin de ne pas retirer les morceaux de gel. Déshydratez l’échantillon avec du nitrile 100 % acéto pendant cinq minutes et retirez le liquide libre. Ensuite, pour réduire les liaisons disulfure de protéine à 10 millimolaires de DTT et incuber pendant 30 à 45 minutes à 56 degrés Celsius en secouant, retirez maintenant le liquide libre jusqu’aux résidus d’alkylate cystéine.

Ajoutez 55 millimolaires de chloroacétamide pendant 20 à 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Retirez le liquide libre, puis lavez les morceaux de gel deux fois avec du nitrile à 50 % d’acéto pendant 10 minutes. Retirez le liquide libre.

Maintenant, déshydratez les morceaux de gel avec du nitrile 100 % acéto pendant cinq minutes et retirez le liquide libre pour le Triptych Digest. À 40 microlitres de solution de trypsine, laissez les morceaux de gel se réhydrater pendant 10 minutes avec suffisamment de tampon de digestion pour couvrir les morceaux de gel. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour arrêter la digestion et extraire les peptides des morceaux de gel à 5 % d’acide formique pendant cinq à 10 minutes.

Transférez ensuite le supernat dans un nouveau tube, séchez les peptides par lyophilisation ou à l’aide d’un concentrateur sous vide, et stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Cette expérience purifie le complexe kinase P-R-F-P-T-O de nacoa hamana, un NACOA hamana transgénique exprimant 35 SPTO a été transformé transitoirement avec 35 SPRF flag, et le complexe a été immunoprécipité avec Anti-Flag M two aros. L’immunotransfert illustre une immunoprécipitation efficace de la protéine PRF ciblée, à la fois la PTO et la protéine effectrice en interaction co-purifiées avec la PRF, comme indiqué par la détection des anticorps et l’analyse par spectrométrie de masse.

Ici, la stratégie consistait à cibler la protéine PTO avec Anti-Flag. La stratégie a été modifiée. Afin d’identifier les sites de phosphorylation de la PTO.

La quantité totale de protéine PTO comprenant à la fois le complexe PRF et la forme libre a été immunoprécipitée avec l’Anti-Flag M two aros et soumise à un fractionnement de page SDS, à une digestion par triptyque d’ingel et à une analyse spectrométrique de masse, ce qui a donné des peptides PTO couvrant environ 80 % de sa séquence. Il est intéressant de noter qu’un ensemble de sites de phosphorylation uniques pour les peptides PTO a été identifié. Notez que les sites de double phosphorylation n’ont été identifiés qu’en présence de l’une ou l’autre des protéines effectrices.

Il est important d’obtenir des quantités suffisantes de protéines végétales afin d’identifier les composants d’un complexe protéique et de détecter la modification post-traductionnelle d’une protéine d’intérêt. N’oubliez pas que la cartographie des modifications telles que la phosphorylation nécessite une quantité raisonnable de protéines provenant de la spectrométrie de masse, de sorte qu’au moins une faible bande devrait être évidente sur votre gel après cette procédure. D’autres méthodes, comme I, l’identification de composants complexes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que comment l’activation des complexes immunitaires conduit à l’immunité fonctionnelle.

N’oubliez pas que travailler avec des tampons organiques, des bactéries et des BBL de rasoir peut être extrêmement dangereux, alors prenez des précautions telles que le port de gants et de manteaux.