Capture interactine d'ARNm à partir de protoplastes végétaux

L'objectif général de cette méthode optimisée de capture de l'interactome ARNm est d'isoler et d'identifier un protéome lié à l'ARNm à partir de cellules végétales. Cette méthode est appliquée à des protoplastes mésophylliens de feuilles d'arabidopsis thaliana, un type cellulaire utilisé comme outil polyvalent dans divers essais cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes, telles que la découverte et la compréhension du rôle des protéines végétales liant les ARN messagers.

Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à isoler et à identifier un messager végétal sur un protéome lié directement à partir d'un environnement physiologique. Ainsi, cette méthode permet d'obtenir des informations sur les protéines liées à l'ARN messager provenant de protoplastes mésophylliens de feuilles d'arabidopsis. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les protoplastes ou tissus d'autres plantes.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en remarquant qu'elle avait été appliquée avec succès aux lignées cellulaires de levure et de mammifères. Isolez les protoplastes mésophylliens de feuilles d'arabidopsis pour deux échantillons différents, comme décrit dans le protocole écrit. Conservez l'échantillon témoin qui ne sera pas réticulé par UV, ou échantillon non-CL, sur glace.

Transférez la suspension de protoplastes à réticuler, ou échantillon CL, dans une grande boîte de Pétri. Ajoutez 30 millilitres de solution MMG glacée dans la boîte pour recouvrir la surface, puis répartissez les cellules par pipetage doux. Couvrez la boîte de Pétri avec du papier d’aluminium lors de son transport vers l’appareil de réticulation UV.

Placer immédiatement la boîte de Pétri ouverte dans un appareil de réticulation UV. S'assurer que la distance entre la boîte et la lampe UV est de huit centimètres, puis irradier l'échantillon pendant une minute. Ensuite, aliquoter rapidement la suspension de protoplastes de la boîte de Pétri dans deux nouveaux tubes ronds de 50 millilitres.

Lavez le fond de la boîte avec cinq millilitres supplémentaires de solution MMG glacée afin de récupérer le reste des protoplastes. Répartissez le surnageant entre les deux tubes. Ensuite, centrifugez les échantillons non-CL et les deux échantillons CL à 100 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après avoir éliminé le surnageant, remettez le tube contenant le culot non CL sur de la glace. Ajoutez 10 millilitres de solution MMG glacée à chaque tube d’échantillon CL et agitez doucement les tubes pour redisperser les culots. Après avoir combiné les deux échantillons dans un seul tube rond de 50 millilitres, centrifugez à 100 × g à quatre degrés celsius pendant cinq minutes.

Après avoir éliminé le surnageant, conservez le culot sur de la glace. Ajoutez ensuite neuf millilitres de tampon de lyse et de liaison glacé au culot cellulaire de chaque échantillon. Lysez les protoplastes en aspirant et en expulsant environ vingt fois à l’aide d’une pipette, jusqu’à ce que la solution présente une couleur verte pâle homogène.

Pour l'homogénéisation, faites passer deux fois le lysat de protoplastes à travers une seringue en verre de 50 millilitres munie d'une aiguille fine, puis incubez le lysat sur de la glace pendant dix minutes. Congelez les échantillons dans de l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pendant un maximum de trois semaines. Après décongélation du tube contenant le lysat de protoplastes congelé à température ambiante, maintenez le tube sur de la glace.

Prélevez 1,8 millilitre d'oligonucléotides-d(T) liés à des billes magnétiques dans six nouveaux tubes microcentrifugeurs coniques de deux millilitres placés sur de la glace. Lavez la suspension de billes dans chaque tube avec 600 microlitres de tampon de lyse et de liaison en pipetant brièvement plusieurs fois de haut en bas, puis faites tourner doucement les billes sur un agitateur rotatif pendant deux minutes. Conservez les billes sur de la glace.

Ensuite, placer les six tubes contenant les billes dans un support magnétique pendant au moins trois minutes afin de permettre une capture magnétique complète. Lorsque les billes sont entièrement capturées, la suspension devient limpide. Puis, éliminer le surnageant des six tubes et aliquoter immédiatement neuf millilitres de lysat de protoplastes dans chacun d’eux.

Mélangez les billes avec le lysat à l’aide d’une pipette jusqu’à ce que la suspension apparaisse brune et homogène. Incubez les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure avec une rotation douce. Après l’incubation, replacez les tubes dans le support magnétique pendant trois minutes.

Lorsque toutes les billes sont retenues sur le côté des tubes, recueillir le surnageant contenant le lysat de protoplastes dans six nouveaux tubes de microcentrifugeuse ronds de deux millilitres. Ensuite, ajouter 1,5 millilitre de tampon de lavage froid (tampon 1) dans chaque tube contenant les billes, puis resuspendre les billes par pipetage. Après une rotation douce pendant une minute, replacer les tubes dans le support magnétique pendant trois minutes.

Jetez le surnageant et répétez cette étape de lavage une fois. À l’aide de 1,5 millilitre de tampon de lavage deux glacé, répétez la même procédure de lavage deux fois. Si les mRNP ont été efficacement isolées à partir du lysat de protoplaste, un halo doit être visible autour du culot de billes dans l’échantillon CL.

Enfin, répétez la procédure de lavage une fois avec 1,5 millilitre de tampon à faible concentration saline, préalablement refroidi sur glace. Après le lavage, ajoutez 500 microlitres de tampon d’élution dans chaque tube, puis redisperser délicatement les billes à l’aide d’une pipette. Incubez à 50 degrés celsius pendant trois minutes afin de libérer les ARN portant une queue poly-A.

Re-suspendez délicatement les billes en pipetant une fois, puis replacez les tubes dans le support magnétique à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez et combinez les éluants provenant des six tubes dans un tube conique de 15 millilitres placé sur de la glace. Cela donnera environ trois millimètres d’éluant.

La qualité et la quantité d'ARN peuvent être déterminées immédiatement à l'aide d'un spectrophotomètre. Préparez les billes oligo-d(T) à réutiliser en les lavant deux fois avec un millilitre de tampon d'élution froid. Ensuite, lavez-les avec un millilitre de tampon de lyse et de liaison froid pour réajuster la concentration en sels à 500 millimolaire.

Utilisez ces billes oligo-d(T) lavées pour répéter les procédures de liaison, de lavage et d'élution deux tours supplémentaires. Cela permettra d'épuiser les ARN à queue poly-A du lysat de protoplastes et de produire un total de neuf millimètres d'éluate pour chaque échantillon. Les billes peuvent être conservées et réutilisées pour une autre expérience jusqu'à trois fois maximum.

Pour tester la qualité de l'ARN, digérez les protéines réticulées par UV avec une solution de protéinase K selon le protocole indiqué. Ensuite, purifiez l'ARN à l'aide du kit de purification de l'ARN afin d'éliminer toute contamination résiduelle. Après la purification, les échantillons sont prêts pour le test de qualité de l'ARN par qRT-PCR.

Commencez par traiter huit millilitres de chaque échantillon avec 100 unités de cocktail d'ARNase contenant de l'ARNase A et de l'ARNase T1. Après un bref vortexage, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour concentrer les protéines liant l'ARNm, ou mRBP, filtrez les échantillons à l'aide d'unités de filtration centrifuges. Chaque échantillon produira 75 microlitres contenant deux microgrammes de protéine.

Pour un stockage à long terme, congeler les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Pour réaliser un gel SDS-PAGE, mélanger 25 microlitres de chaque échantillon concentré avec 15 microlitres de colorant de charge 2X et chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Déposer les échantillons avec un marqueur de protéines sur un gel SDS-PAGE comportant un gel de concentration à cinq pour cent et un gel de séparation à douze pour cent.

Ensuite, lavez le gel deux fois avec de l'eau ultrapure pendant cinq minutes par lavage. Utilisez un kit de coloration argent commercial pour colorer le gel. Si le nombre suffisant de protoplastes initiaux a été utilisé, les bandes protéiques apparaîtront dans les cinq minutes.

Pour tester davantage les mRBP, purifiez les peptides à partir d'un deuxième gel 1D comme expliqué dans le protocole textuel. Ces peptides purifiés peuvent désormais être analysés par chromatographie liquide nano-phase inverse, spectrométrie de masse, et protéomique qualitative et quantitative. Après la capture sur billes d'oligo-d(T), la qRT-PCR a révélé des niveaux significativement plus élevés d'ARNm de référence de polyubiquitine 10 par rapport à l'ARNr 18S.

Étant donné que les billes oligo-d(T) ne se lient qu'à l'ARN portant une queue poly-A, cela indique que les ARNm sont enrichis dans l'éluat. La capture des mRBP par les billes oligo-d(T) est en outre évaluée par une électrophorèse SDS-PAGE révélée par une coloration argent. Le gel montre une quantité nettement plus élevée de protéines dans l'échantillon CL cross-linké par UV par rapport à l'échantillon non cross-linké (non-CL).

La durée de l'irradiation UV peut influencer l'efficacité de la réticulation. Ce gel SDS-PAGE coloré à l'argent confirme qu'une ou trois minutes d'irradiation UV constituent la condition optimale, avec des intensités de bandes maximales. Un total de 325 protéines a été identifié par analyse protéomique quantitative.

225 de ces protéines se situaient en dessous du seuil de significativité en raison de peptides peu abondants présents pour chaque protéine, ainsi qu'une forte variabilité des intensités des peptides. Toutefois, comme toutes ces protéines ont été détectées qualitativement uniquement dans les échantillons CL, elles ont toutes été considérées comme des résultats positifs. Ces 325 protéines ont ensuite été classées en trois catégories : protéines ribosomales, principaux RBP et RBP candidats.

L'absence de domaines de liaison conventionnels à l'ARN chez les protéines liantes d'ARN candidates, ainsi que le fait que la plupart de leurs rôles n'aient pas été validés, suggère des fonctions potentiellement nouvelles dans la régulation de l'ARN. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement. Depuis son développement, cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs spécialisés dans les voies de régulation moléculaire chez les plantes pour explorer le protéome lié aux ARN messagers à l'échelle du génome, dans les cellules et tissus des dicotylédones et des monocotylédones.