Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer l’expression génique transitoire d’un rapporteur marqué à la GFP dans des cellules épidermiques de feuilles de tabac. Ceci est réalisé en concevant d’abord une construction d’ADN qui sera exprimée dans le chloroplaste et les peroxysomes. La construction est ensuite construite à l’aide de l’amplification PCR et de l’assemblage Gibson.

Ensuite, un pistolet à gènes est utilisé pour délivrer la construction aux cellules épidermiques des feuilles de tabac. En fin de compte, l’imagerie de la feuille de tabac par microscopie confocale révèle l’expression de la GFP dans le chloroplaste et le peroxysome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le clonage classique, est qu’elle ne nécessite pas d’enzymes de restriction, et donc, toute séquence pouvant être amplifiée par PCR peut être clonée.

En raison de la flexibilité de la conception génétique, les applications de ces techniques s’étendent à une plus grande échelle. Génie génétique des plantes agricoles Commencez ce protocole en déterminant les sites à l’intérieur de la cellule végétale pour l’expression finale des protéines. Pour ce travail, l’objectif est de cibler l’expression du chloroplaste, du peroxysome et du cytosol.

Ensuite, concevez la construction de l’expression. La construction doit contenir un promoteur, un gène détectable et un terminateur dans un seul plasmide. Dans ce cas, le promoteur constitutif P fin deux pilote l’expression de la GFP, qui est suivie par la synthèse de Nolene, terminator ou nos t.

Notez que dans cette expérience, nous testerons une série de marqueurs, des marqueurs trit, un, deux et trois exprimés à l’extrémité terminale de la GFP pour l’expression dans le chloroplaste et les peroxysomes. La méthode d’assemblage Gibson dépend de l’action de plusieurs enzymes dans un mélange préfabriqué pour digérer partiellement les extrémités de l’ADN double brin et faciliter le recuit des paires de bases complémentaires des séquences d’ADN voisines. La construction finale comporte trois parties qui doivent être amplifiées en quatre réactions PCR avant l’assemblage de Gibson.

La première et la deuxième réaction amplifient un vecteur plasmidique de 8 000 paires de bases, PORE, qui contient GFP NOS T et un marqueur de résistance cany. Le marqueur de résistance est un bon endroit pour diviser ce grand ADN en deux matrices plus petites qui sont plus facilement amplifiées par PCR. La troisième réaction amplifie le promoteur P fin de la coupelle deux, et la quatrième réaction amplifie la troisième en utilisant un logiciel de conception in silico tel que la conception de singes, la construction base par base, de sorte qu’il y a un chevauchement de 50 paires de bases entre chaque pièce.

Lors de la commande d’amorces pour PCR, il est possible d’utiliser le chevauchement de 50 paires de bases comme les amorces 25 paires de bases dans chaque direction Après avoir effectué une PCR pour amplifier chaque composant, purifiez le produit PCR séparément et diluez-le dans de l’eau déminéralisée distillée. Si le modèle PCR était une mini-préparation à partir d’un traitement à E. coli avec l’enzyme de restriction DPN, on supprimera l’ADN modèle contaminant. Ensuite, mesurez les concentrations de chacun des morceaux d’ADN.

Ajustez la concentration du vecteur à environ 150 nanogrammes par microlitre pour chaque construction à assembler, y compris un contrôle, sortez une aliquote de 15 microlitres du mélange Gibson Assembly du congélateur et décongelez-la sur de la glace. Utilisation de l’open source en ligne tool@gibbon. org, déterminez les volumes pour les quantités équimolaires de chacun des fragments.

Ajoutez le volume calculé de chacun des fragments au mélange Gibson de 15 microlitres. Préparez également un contrôle de l’ADN vecteur seul. Le volume total de chaque réaction doit être de 20 microlitres.

Utilisez de l’eau pour ajuster le volume si nécessaire. Incuber les tubes à 50 à 55 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l’incubation, remettez les tubes sur de la glace.

Retirez un tube de micro-fuge contenant une préparation commerciale de 200 microlitres de chlorure de calcium compétent e coli d’un congélateur à moins 80 degrés Celsius, et réchauffez-le légèrement à la main. Ajoutez ensuite les 20 microlitres de la réaction à l’e coli. Incuber les cultures sur de la glace pendant 30 minutes, puis transférez-les dans un bain-marie à 42 degrés Celsius et un choc thermique pendant 60 secondes.

N’utilisez pas de piles électrocompétentes. La concentration relativement élevée de sel et la faible concentration d’ADN peuvent provoquer un arc électrique des cellules après la transformation. Remettez les cultures dans ICE pendant deux minutes, puis appliquez 750 microlitres de milieu SOC ou LB et laissez-les récupérer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Plaque suivante, le mélange sur des plaques LB avec du cany ou un autre antibiotique approprié incube à 37 degrés Celsius pendant la nuit cribler 10 colonies par séquençage. Notez que cette méthode peut entraîner un bruit de fond plus élevé et un nombre plus élevé d’événements de recombinaison non cibles que le clonage traditionnel basé sur la ligature. La transfection biotique du tabac avec un pistolet à gènes a déjà été décrite dans JoVE.

Ici, les étapes clés et les différences par rapport aux protocoles précédents sont passées en revue. Après avoir amplifié et isolé les constructions, préparez des balles de pistolet à gènes comme décrit dans l’article JoVE de Woods et Zeto et chargez-les dans le pistolet à gènes pour la transfection du tissu épidermique des feuilles de tabac de Nico Tania Benham Miana. Choisissez une grande feuille près de la base d’une plante de trois à cinq mois.

Placez-le soigneusement sur du papier absorbant humide dans une boîte de Pétri de 15 centimètres en portant une protection oculaire et auditive appropriée. Réglez la pression d’hélium pour le pistolet à gènes sur 200 à 250 PS. Je vise soigneusement le pistolet à gènes entre les côtes de la face inférieure d’une feuille, à environ trois à cinq centimètres au-dessus de celle-ci. Relâchez la sécurité et livrez les particules à la feuille.

Utilisez chaque balle deux fois au même endroit sur la feuille. Déplacez-vous vers un autre endroit et répétez le processus si la feuille explose, jetez-la et commencez une nouvelle feuille. Il y a une certaine variation dans la ténacité des feuilles en raison des conditions de croissance telles que l’âge, l’humidité, etc.

Une fois que tous les clichés ont été livrés, couvrez la feuille et stockez-la deux à trois jours en basse lumière sur le banc. Examinez la feuille à l’aide d’un microscope disséquant équipé d’une fluorescence UV et recherchez des cellules individuelles exprimant la GFP. Lorsque des cellules exprimant la GFP sont trouvées, utilisez des ciseaux de dissection pour extraire soigneusement des sections de cinq à dix millimètres de feuille.

Immergez immédiatement chaque fragment de feuille dans le puits d’une lame de microscope à puits profond contenant environ 200 microlitres de 0,1 % Triton X 100. Le détergent aide à empêcher la formation de bulles d’air à la surface, et la lame de microscope à puits profond permet d’imager des cellules d’imagerie tissulaire plus grande à l’aide d’un microscope confocal équipé des filtres appropriés et d’un objectif d’immersion dans l’eau 40x. Dans cette étude, les trois différentes constructions de ciblage des organites GFP ont été comparées à la GFP untag et à un rubis. Coag.

La microscopie confocale GFP a été utilisée pour détecter la fluorescence de la GFP dans les cellules individuelles transformées transitoirement dans des expériences de contrôle dans lesquelles la GFP non marquée a été exprimée. La fluorescence n’est observée que dans le noyau et le cytosol, mais pas dans le chloroplaste, qui sont identifiés par l’autofluorescence rouge de la chlorophylle comme on le voit dans cet exemple d’une cellule transfectée avec un chloroplaste uniquement Rubis Oag. La GFP a été exprimée dans les grands organites.

La cellule est entourée de blanc. Le jaune indique les zones de colocalisation de la construction avec la chlorophylle, indiquant que la construction est ciblée sur le chloroplaste, comme le montre cette image d’une cellule transfectée, l’expression de la GFP est observée dans le chloroplaste, les périphéries, le cytosol et les petits organites ponctués que l’on croit être des peroxysomes. De même, les cellules transfectées triag two expriment également la GFP dans le cytosol du chloroplaste et les peroxysomes triag trois, qui consistent en un signal de peroxysome intégré dans une région de faible complexité de la séquence du chloroplaste, localisée uniquement dans le chloroplaste et le peroxysome.

Notez que cette cellule se trouve dans une couche de feuille différente. Cette figure résume l’expression observée dans les compartiments d’une cellule épidermique typique d’une feuille de tabac. Les tailles et les emplacements relatifs à l’intérieur de la cellule sont montrés et les niveaux d’expression relatifs observés par transfection du pistolet génétique et microscopie confocale.

Notez que le untag GFP se localise dans le cytosol et le noyau, le contrôle PIMT deux GFP se localise dans le chloroplaste et triag une GFP, triag deux GFP et Triag 3G FP localisé dans le chloroplaste et le peroxysome comme prédit, Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire un plasma avec l’assemblage Gibson, l’administrer directement aux feuilles de tabac et observer l’expression de la GFP dans les trois jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser 150 nanogrammes par microlitre d’ADN vectoriel pour l’assemblage Gibson, et 1500 nanogrammes par microlitre de votre construction finale d’ADN pour fabriquer vos balles de pistolet à gènes.