Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l'étude du brin positif de virus à ARN

L'objectif général de cette procédure est de récupérer des particules virales infectieuses produites entièrement à partir d'un ADNc cloné de virus à ARN à brin positif, dont le génome possède la même polarité que l'ARNm cellulaire, comme le virus de l'encéphalite japonaise. Cette génétique inverse basée sur l'ADNc est une méthode fondamentale qui permet la manipulation directe de l'ARN génomique viral, permettant ainsi la génération de virus recombinants pour l'étude moléculaire et génétique de la réplication virale et de la pathogenèse. Cette technique fournit également une plateforme précieuse permettant le développement de vecteurs viraux vaccinales génétiquement définis pour la délivrance de gènes étrangers.

Ces méthodes s'appliquent au clonage de l'ADNc complet pour des souches à ARN de polarité négative ou positive, en particulier pour les virus dont le génome dépasse 10 kb. Plusieurs membres de mon laboratoire démontreront la procédure : l'assistante de recherche Sang-Im Yun, les chercheurs postdoctorants Byung-Hak Song et Jin-Kyoung Kim, ainsi que l'étudiante de premier cycle Jordan Frank.

La partie vidéo de cette publication couvre la préparation du chromosome artificiel bactérien contenant les séquences d'intérêt, la synthèse de l'ARN transcrit à partir du plasmide d'origine, ainsi que la mesure de l'infectiosité de l'ARN et du rendement viral. Toutes les procédures utilisées avant la génération du plasmide BAC sont décrites en détail dans le protocole écrit. Pour cette procédure, commencez par cultiver une colonie isolée d’E. coli DH10B, portant le plasmide BAC, dans trois millilitres de bouillon 2X YT contenant du chloramphénicol. Incubez la culture pendant 10 heures à 35 degrés Celsius sous agitation à 225-250 tr/min.

Après 10 heures, augmenter l'échelle de la culture. Ensuite, inoculer 500 microlitres de culture dans 500 millilitres de milieu et cultiver l'inoculum pendant six heures avec agitation vigoureuse. Après six heures, centrifuger la culture bactérienne dans 2 bouteilles de 250 millilitres à 3 100 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Puis resuspendre chaque culot dans 30 millilitres de solution GTE.

Ajouter 500 microlitres de lysozyme et incuber les suspensions sur de la glace pendant 10 minutes. Pendant ce temps, préparer une solution de lyse fraîche pour l'étape suivante. Après 10 minutes, ajouter 60 millilitres de la solution de lyse et mélanger en agitant doucement jusqu'à ce que la solution devienne limpide.

Laisser les réactions se dérouler à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajouter 45 millilitres de solution de neutralisation dans chaque flacon et retourner les flacons jusqu'à ce qu'ils soient complètement mélangés. Puis les placer sur de la glace pendant 10 minutes.

Recueillir les lysats neutralisés par centrifugation réfrigérée à haute force g. Ensuite, récupérer les surnageants dans deux nouveaux flacons de 250 millilitres. Ajouter 0,6 volume d’isopropanol à 100 % à chacun et les placer sur de la glace pendant 20 minutes.

Ensuite, centrifuger les précipités, puis éliminer les surnageants et dissoudre les culots dans cinq millilitres de tampon TE. Combiner les deux volumes dans un seul tube de 50 millilitres et précipiter l'ARN en ajoutant un volume égal de chlorure de lithium à cinq molaire et en incubant une durée de 10 minutes sur de la glace. Utiliser une centrifugation froide de 20 minutes pour recueillir le précipité d'ARN.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 250 millilitres, ajoutez deux volumes d'isopropanol à 100 % et placez le tube sur de la glace afin que le précipité d'ADN se forme. Après 20 minutes, centrifugez pour faire tomber le précipité, aspirez le surnageant, resuspendez le culot d'ADN dans 9,5 millilitres de tampon TE et transférez la solution d'ADN dans un tube de 50 millilitres.

Poursuivez la préparation en mettant en place le gradient de chlorure de césium avec du bromure d'éthidium. Chargez le mélange dans un tube en polypropylène scellable à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 18 gauge et scellez le tube. Faites tourner le tube scellé toute la nuit dans une ultracentrifugeuse afin de former un gradient de chlorure de césium.

Le lendemain, récupérez une bande d'ADN de plasmide BAC à partir du gradient de chlorure de césium. Utilisez une aiguille de 18 gauge pour créer un orifice de ventilation en haut du gradient et une aiguille de 20 gauge munie d'une seringue pour prélever l'ADN BAC sur le côté du gradient, puis transférez le prélèvement dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Effectuez un lavage, ajoutez 2,5 volumes de butanol saturé en eau et mélangez par vortexage normal.

Ensuite, centrifuger le mélange à température ambiante et transférer la phase aqueuse inférieure dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Répéter ce lavage un total de six fois afin d'éliminer tout le bromure d'éthidium. Précipiter maintenant l'ADN BAC. Ajouter un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M et 2,5 volumes d'éthanol à 100 % dans le tube. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifuger le précipité à température ambiante et laver le culot d'ADN avec un millilitre d'éthanol à 70 %. Répéter la centrifugation et récupérer à nouveau le culot. Enfin, sécher le culot d'ADN à l'air pendant 10 minutes et l'éluer dans 200 microlitres de tampon TE.

Commencez par une digestion à grande échelle du plasmide BAC par l'enzyme de restriction Xba-one dans un volume total de 100 microlitres. Effectuez cette digestion à 37 degrés Celsius pendant 12 à 15 heures. Ensuite, poursuivez l'incubation de la digestion avec 25 unités supplémentaires de nucléase de haricot mungo à 30 degrés Celsius pendant deux heures.

Après l'incubation, ajustez le volume à 300 microlitres avec de l'eau distillée. Effectuez ensuite une extraction au phénol en ajoutant un volume équivalent de phénol-chloroforme, alcool isoamylique à l'échantillon dilué, en vortexant vigoureusement pendant une minute, en centrifugeant le tube, puis en transférant la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.

Ensuite, répétez l'extraction avec du chloroforme. Puis, récupérez l'ADN BAC linéarisé par précipitation à l'éthanol. Ramassez le culot d'ADN par centrifugation, jetez le surnageant et lavez le culot avec un millilitre d'éthanol à 70 %. Répétez l'étape de centrifugation et séchez le culot à l'air libre. Après 10 minutes de séchage, dissolvez le culot d'ADN dans 30 microlitres d'eau distillée. Ensuite, analysez un microlitre de l'ADN BAC récupéré sur un gel d'agarose à 0,8 %.

Ensuite, préparez une transcription de type runoff de 25 microlitres d'ADN BAC linéarisé, incluant de l'UTP tritié pour la quantification de l'ARN. Effectuez la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Puis, analysez un ou deux microlitres de la réaction de transcription de type runoff sur un gel d'agarose à 0,6 %.

Commencez avec des cellules BHK-21 cultivées pendant 24 heures dans des boîtes de 150 millimètres ensemencées à raison de 3 millions de cellules par boîte. Rincez la monocouche cellulaire avec la solution A froide, puis détachez les cellules par trypsination. Récupérez les cellules par centrifugation à 270 g pendant deux minutes.

Ensuite, resuspendre les cellules dans 50 millilitres de solution A froide et les centrifuger à nouveau. Répéter ce lavage trois fois. Après le dernier lavage, resuspendre les cellules à une concentration de 20 millions par millilitre dans la solution A. Puis mélanger un aliquot de 400 microlitres de la suspension cellulaire avec deux microgrammes d'ARN synthétique dans une cuvette de deux millimètres.

Électroporer rapidement le mélange dans des conditions optimales et laisser les cellules reposer pendant 10 minutes. Transférer ensuite les cellules dans un tube microfuge contenant 600 microlitres de milieu de culture complet. Préparer maintenant des dilutions sériées d’un facteur dix des cellules électroporées, dans des volumes d’un millilitre. Ensemencer 100 microlitres d’aliquote de chaque dilution sur des monocouches de cellules BHK21 normales. Après quatre à six heures d’incubation, recouvrir les cellules avec de l’agarose à 0,5 % dans le milieu MEM supplémenté en FBS et les cultiver pendant quatre jours supplémentaires.

Des cellules BHK21 ont été soumises à une électroporation témoin ou à une électroporation avec des transcrits d'ARN dérivés de deux clones indépendants du JEV-BAC de longueur complète. Quatre jours plus tard, les cellules ont été colorées au violet de crésyl pour visualiser l'ARN infectieux dans les cellules. À l'aide de cette coloration, les centres infectieux ont été quantifiés. Ensuite, l'expression des protéines virales a été examinée dans les cellules électroporées avec l'ARN 20 heures après la transfection, en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-NS1 et un anticorps secondaire marqué au Cy3, apparaissant en rouge. Les noyaux ont été contre-colorés au DAPI, visible en bleu. Ultérieurement, à 22 et 40 heures après la transfection, la production de virions infectieux accumulés dans les surnageants de culture des cellules électroporées avec l'ARN a été analysée par des dosages de plaques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler un virus infectieux entièrement à partir d'un ADNc cloné d'une souche à ARN positif, comme le virus de l'encéphalite japonaise. N'oubliez donc pas que travailler avec le virus de l'encéphalite japonaise et d'autres agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux. Une formation adéquate en biosécurité est nécessaire avant d'effectuer cette procédure.