Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l'aide traditionnels et nouveaux

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la concentration virale par quantification des particules infectieuses en comptant les plaques distinctes en culture cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en semant des cellules afin de former une monocouche confluente destinée à l'infection. La deuxième étape consiste à effectuer des dilutions sériées de l'échantillon viral inconnu à quantifier. Ensuite, les monocouches confluentes sont infectées à l'aide des dilutions sériées du stock viral, suivies de l'application d'une couche de recouvrement immobilisante. La dernière étape consiste à fixer et colorer les plaques après un temps d'incubation approprié pour le virus en question afin de compter les plaques distinctes. En définitive, les tests de plaques peuvent être utilisés et modifiés de diverses manières afin de déterminer les titres viraux d'un échantillon viral inconnu.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la couche semi-solide, est que son application et son retrait sont nettement plus simples, tant dans les applications à haut débit que dans les applications traditionnelles. En outre, aucun chauffage des réactifs n'est nécessaire. Les implications de cette technique s'étendent à la recherche sur de nombreux virus lytiques différents, car l'utilisation d'une couche liquide dans un format 96 puits permet le criblage rapide de nouveaux composés thérapeutiques, ce qui peut considérablement réduire les longues heures passées en laboratoire à réaliser des dosages classiques de plaques.

La veille du test, ensemencez les cellules appropriées pour le virus en question afin d'obtenir une confluence de 90 à 100 % le jour de l'infection. Les solutions mères peuvent également être préparées la veille du test. Préparez tout d'abord une solution de fixation contenant 10 % de formaldéhyde dans de l'eau distillée en mélangeant 5,56 millilitres de formaldéhyde à 36 % avec 14,44 millilitres d'eau distillée. Préparez ensuite la solution de coloration au violet de crésyl constituée de 1 % de violet de crésyl dans 20 % d'éthanol, diluée avec de l'eau distillée. Ensuite, en travaillant en conditions stériles, préparez le milieu de plaque 2x approprié pour le type de cellules utilisé. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micron si l'un des réactifs n'est pas stérile. Pour préparer une couche liquide destinée à être utilisée dans le test de plaque, ajoutez 2,4 grammes d'Avicel à un flacon contenant 97,6 millilitres d'eau distillée en agitation rapide à l'aide d'un barreau aimanté. Mélangez la solution à température ambiante jusqu'à ce qu'elle devienne trop visqueuse pour permettre la rotation du barreau. À ce stade, transférez le flacon sur un agitateur rotatif et agitez vigoureusement pendant 30 minutes afin d'assurer une homogénéisation uniforme. Enfin, stérilisez la solution en autoclave à 121 degrés Celsius et 14 PSI pendant 30 minutes.

Et une fois que le programme est terminé, conserver scellé à température ambiante. Pour une couche de recouvrement en agarose, préparer une solution mère d'agarose à 0,6 % dans de l'eau distillée, mélanger à l'aide d'un barreau aimanté et stériliser à l'autoclave pour obtenir une solution homogène. Pour une couche de recouvrement en carboxyméthylcellulose, préparer une solution de carboxyméthylcellulose à 2 % dans de l'eau distillée et mélanger. Puis stériliser à l'autoclave comme précédemment.

Le jour suivant la mise en culture, utilisez un microscope inversé pour vérifier la confluence et la viabilité des cellules avant de commencer le test. Assurez-vous que les cellules présentent une morphologie cellulaire standard et une confluence d’environ 90 %.

Réalisez une dilution sérielle par facteur dix des échantillons infectieux dans du milieu de croissance cellulaire, en faisant varier le nombre de dilutions en fonction du titre attendu du virus en question. Préparez également un échantillon témoin non infecté afin de garantir indépendamment la viabilité cellulaire et de faciliter l'identification des plaques. Prélèvez à la pipette le témoin non infecté et les dilutions sérielles, puis ajoutez-les dans les puits de la plaque en prenant soin de ne pas perturber la monocouche.

Utilisez un volume suffisant d'inoculum pour recouvrir les cellules tout en maintenant le volume aussi faible que possible afin de maximiser le contact viral avec la monocouche. Placez les plaques dans l'incubateur de culture tissulaire et infectez les cellules pendant 45 minutes à une heure. Toutes les 20 minutes, agitez doucement les plaques pour assurer une répartition uniforme et empêcher la monocouche cellulaire de sécher.

Pendant l'infection, préparez la solution de travail pour les couches liquides. Mélangez à parts égales du milieu de plaque réchauffé et de la solution mère d'Avicel à 1,2 à 2,4 % à température ambiante afin d'obtenir une solution de travail contenant 0,6 à 1,2 % de milieu de recouvrement à l'Avicel. Pour les recouvrements à base d'agarose ou de CMC, mélangez à parts égales du milieu de plaque réchauffé et une solution mère contenant soit 0,6 % d'agarose chauffée, soit 2 % de CMC. Placez ensuite le mélange dans un bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes afin d'assurer l'équilibre thermique. Vérifiez que la solution est tiède mais pas chaude au toucher afin d'éviter la mort cellulaire et une diminution des titres viraux. Après l'infection, appliquez les recouvrements sur les monocouches infectées. Après ajout du recouvrement, incubez les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à quatorze jours, selon le virus analysé.

Pour fixer les cellules avec une couche liquide, versez ou aspirez la couche d'Avicel, puis ajoutez à la pipette une solution de formaldéhyde à 10 % dans les puits et fixez à température ambiante pendant 30 minutes à toute la nuit. Pour l'agarose ou le CMC, ajoutez directement la solution de formaldéhyde dans la couche pendant une heure à toute la nuit à température ambiante. Après la fixation, éliminez le formaldéhyde, puis retirez manuellement les bouchons semi-solides de l'agarose à l'aide d'une spatule.

Rincez les plaques de cellules Avicel à l'eau pour éliminer le fixateur résiduel de la couche de recouvrement avant la coloration.

Recouvrir les cellules d'une quantité minimale de solution de violet de cristal pendant environ 15 minutes. Agiter délicatement les plaques si nécessaire afin d'assurer une couverture uniforme. Rincer doucement l'excès de colorant violet de cristal à l'eau. Une fois fixés, colorés et séchés, conserver les plaques indéfiniment pour des analyses ultérieures. Compter les plaques dans chaque puits, en excluant les puits contenant moins de cinq ou plus de 100 plaques. Calculer la moyenne pour les réplicats techniques d'une même dilution. Prendre note de la taille et de la morphologie des plaques. Déterminer le titre viral de l'échantillon d'origine en multipliant le nombre moyen de plaques obtenu pour une dilution par l'inverse du facteur de dilution total.

Cette image montre des comparaisons de recouvrements de plaques pour le virus de la fièvre de la vallée du Rift, utilisant des plaques de 12 puits. Les cellules Vero ont été ensemencées à 2,5 fois 10 puissance 5 cellules par puits dans des plaques de 12 puits et infectées avec 200 microlitres en utilisant le même échantillon initial dilué en série du MP-12. Après l'infection, des recouvrements de 1,5 millilitre composés de 0,3 % d'agarose, de 0,6 % d'Avicel ou de 1 % de CMC ont été appliqués afin de comparer directement ces recouvrements. Cet histogramme présente les résultats des dénombrements de plaques et des titrages pour les trois types de recouvrement. Ici, des comparaisons de recouvrements de plaques pour le VEEV, utilisant des plaques de 12 puits, sont montrées. Les cellules Vero ont été ensemencées comme précédemment et infectées avec un volume de 200 microlitres en utilisant le même échantillon initial dilué en série de la souche vaccinale VEEV-TC 83 ; après l'infection, des recouvrements de 1,5 millilitre composés de 0,3 % d'agarose, de 0,6 % d'Avicel ou de 1 % de CMC ont été appliqués comme auparavant.

À nouveau, l'histogramme illustre les résultats des dénombrements de plaques et des titrages pour les trois recouvrements. Cette image présente un exemple de recouvrements de plaques à haut débit. Une plaque de 96 puits contenant des cellules Vero ensemencées à raison de trois fois dix puissance quatre cellules par puits a été infectée avec 50 microlitres d'inoculum, en utilisant le même échantillon initial du virus de la fièvre de la vallée du Rift souche MP 12 dilué en série, pendant une heure et en quadruplant les réplicats. Des concentrations finales de 0,6 et 1,2 % d'Avicel cell ont été testées pour les recouvrements afin d'évaluer la faisabilité et la reproductibilité de l'utilisation de recouvrements liquides dans un contexte à haut débit. Cet histogramme montre les titres déterminés à partir de chaque recouvrement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque virus est différent et que des optimisations, telles que l'utilisation de types cellulaires différents, de durées d'incubation ou de milieux de croissance, peuvent être nécessaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un dosage de plaques de base en utilisant à la fois des recouvrements liquides et semi-solides.