Phénotypage Souris fonction pulmonaire In Vivo Avec le Capacité diffusion pulmonaire
6 janvier 2015
Nous décrivons un moyen de mesurer rapidement et simplement la capacité de diffusion pulmonaire chez la souris et montrons qu’elle est suffisamment sensible aux changements de phénotype dans plusieurs pathologies pulmonaires courantes. Cette métrique apporte donc une pertinence translationnelle directe aux modèles murins, puisque la capacité de diffusion est également facilement mesurable chez l’homme.
L’objectif général de l’expérience suivante est d’apprendre à mesurer la capacité de diffusion des poumons d’une souris à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse calibré. Ceci est accompli en gonflant les poumons d’une souris anesthésiée avec un gaz contenant du néon et du monoxyde de carbone, en retenant le gaz dans les poumons pendant neuf secondes et en recueillant le gaz. Le gaz retiré des poumons est ensuite dilué à deux millilitres et injecté dans le chromatographe en phase gazeuse.
L’absorption différentielle du néon et du monoxyde de carbone dans les poumons est utilisée pour calculer la capacité de diffusion. Cette mesure peut être utilisée pour évaluer la perte de fonction pulmonaire dans un large éventail de modèles de maladies pulmonaires. Le principal avantage de cette technique par rapport à toutes les autres méthodes existantes pour mesurer la fonction pulmonaire chez la souris est qu’il s’agit d’une mesure très simple et reproductible qui peut être directement comparée à des mesures similaires chez l’homme.
Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements dans la structure pulmonaire qui se produisent avec une variété de pathologies pulmonaires. Ce protocole commence par la mise en place du module de chromatographe en phase gazeuse fourni avec l’appareil pour mesurer les pics d’azote, d’oxygène, de néon et de monoxyde de carbone. Pour cette application, seules les données sur le néon et le monoxyde de carbone sont nécessaires.
L’instrument utilise une colonne de tamis moléculaire avec de l’hélium comme gaz vecteur. Ce chromatographe en phase gazeuse particulier a une colonne de 0,8 millilitre et un échantillon de deux millilitres est utilisé pour assurer un dégagement adéquat de cette colonne avant de commencer. Une série de mesures permet toujours d’étalonner la machine à l’aide de deux millilitres de gaz directement à partir du sac d’échantillonnage de gaz.
Le premier pic à apparaître est le néon, puis l’oxygène et l’azote, que l’on ne mesure pas pour cette procédure. Enfin, le pic de monoxyde de carbone apparaît le temps du chromatographe en phase gazeuse. Pour mesurer tous ces pics, il faut un peu moins d’une minute.
Pour commencer, anesthésez les souris avec de la kétamine et de la xylazine. Confirmez l’anesthésie par l’absence de mouvement réflexe en réponse à un pincement de l’orteil. Ensuite, pour protéger les yeux, appliquez une pommade vétérinaire, puis trachéostomies les souris avec une canule à clous.
Utilisez une canule de calibre 18 pour les adultes ou une canule de calibre 20 pour les très jeunes souris. Ensuite, démarrez le métronome avec des clics audibles toutes les secondes. Pour les souris de plus de six semaines, utilisez une seringue de trois millilitres pour retirer 0,8 millilitre de gaz du sac de mélange de gaz.
Si la souris a moins de quatre semaines, utilisez 0,4 millilitre de gaz, puis connectez la seringue à la canule trachéale et gonflez rapidement les poumons. Commencez à compter mentalement de un à 10 en synchronisation avec les clics du métronome. Lorsque le compte atteint 10, prélevez rapidement le volume de 0,8 millilitre.
Diluez ce gaz expiré à deux millilitres en ajoutant de l’espace, de l’air et du poids au moins 15 secondes. Il est très important de gonfler et de dégonfler les poumons le plus rapidement possible. Un gonflage rapide est très facile, mais il faut un peu de pratique pour prélever précisément les 0,8 ml rapidement, puis injecter l’ensemble de l’échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse.
Pour l’analyse, il est important d’éviter la contamination de l’échantillon lors du transfert vers et depuis l’animal et vers le chromatographe en phase gazeuse. Cela peut être fait avec précaution en coiffant le signe avec un doigt pendant que le GC mesure l’échantillon. Gonflez le poumon de souris avec 0,8 millilitre supplémentaire de mélange gazeux du sac, puis traitez cet échantillon de la même manière que le premier.
À l’aide des valeurs moyennes des deux mesures, calculez le DFCO. L’indice C fait référence aux gaz d’étalonnage et l’indice neuf fait référence aux échantillons prélevés sur l’animal. Après l’apnée de neuf secondes.
La valeur nominale du contrôle DFCO prélevée sur des souris noires C 57 est d’environ 0,77. Dans une étude utilisant un modèle de grippe PR huit, une perte progressive de fonction a été observée au sixième et au huitième jour dans un modèle d’emphysème 21 jours après l’installation des élastases. Le DFCO a été modérément diminué, mais il y a eu des changements beaucoup plus importants dans le modèle de fibrose induit par l’installation de Blio Mycin.
La voie fibrotique causée par la bléomycine a entraîné le plus grand changement de DFCO observé dans tous les modèles pathologiques. Ceci est important car la capacité de diffusion est également un marqueur fiable de la fibrose chez l’homme. Le gène CFTR joue un rôle crucial dans la fibrose kystique et dans une étude sur des souris dépourvues de ce gène, il y a eu une diminution significative du DFCO.
La DFCO a encore diminué avec une infection fongique chez ces souris knock-out. Un modèle couramment utilisé pour les lésions pulmonaires est causé par le LPS. Chez les souris exposées au LPS, il y avait une perte progressive de la fonction pulmonaire en fonction du temps du premier au quatrième jour, comme l’ont évalué les mesures du DFCO, la mesure du DFCO peut être effectuée avec succès chez les souris dès l’âge de deux semaines.
La taille plus petite du poumon nécessite un volume de gonflage plus petit de 0,4 millilitre. Le DFCO mesuré avec ce volume plus petit est capable de montrer l’augmentation attendue à mesure que le poumon mûrit Une fois maîtrisé. Cette technique peut être effectuée en quelques minutes seulement par souris avant d’effectuer toute autre mesure ou évaluation de la fonction pulmonaire.
Lors de cette tentative, il est important de s’assurer d’effectuer rapidement l’étape de gonflage et de dégonflage et d’être prudent lors du transfert de l’échantillon afin d’éviter toute contamination.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode de mesure de la capacité de diffusion pulmonaire chez la souris à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse étalonné. Cette technique est sensible aux modifications phénotypiques liées à diverses pathologies pulmonaires, ce qui la rend pertinente pour la recherche translationnelle.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Physiologie respiratoire
- Recherche translationnelle
Contexte
- La capacité de diffusion pulmonaire est une mesure essentielle de la fonction pulmonaire.
- Les méthodes existantes pour mesurer la fonction pulmonaire chez la souris peuvent être complexes.
- Des études comparatives entre souris et humains sont indispensables pour assurer une pertinence translationnelle.
- Des techniques simples et reproductibles sont nécessaires pour une recherche efficace.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode simple pour mesurer la capacité de diffusion pulmonaire chez la souris.
- Évaluer la perte de fonction pulmonaire dans divers modèles de maladies pulmonaires.
- Faciliter les comparaisons des mesures de la fonction pulmonaire entre la souris et l'humain.
Méthodes utilisées
- Insufflation des poumons de souris anesthésiées avec un mélange gazeux contenant du néon et du monoxyde de carbone.
- Rétention du gaz dans les poumons pendant neuf secondes avant la collecte.
- Dilution du gaz prélevé à deux millilitres pour analyse.
- Utilisation d'un chromatographe en phase gazeuse pour mesurer la capture différentielle des gaz.
Résultats principaux
- La méthode fournit une mesure fiable de la capacité de diffusion pulmonaire.
- Elle est sensible aux modifications de la fonction pulmonaire associées à diverses pathologies.
- La technique est simple et reproductible, ce qui renforce son applicabilité en recherche.
- Les résultats peuvent être directement comparés à des mesures similaires effectuées chez l'humain.
Conclusions
- Cette méthode offre un outil précieux pour évaluer la fonction pulmonaire chez les modèles murins.
- Elle soutient la recherche translationnelle en établissant un lien entre les mesures effectuées chez la souris et chez l'homme.
- Des études futures pourront utiliser cette technique pour explorer plus efficacement les pathologies pulmonaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La mesure de la capacité de diffusion pulmonaire chez la souris fournit un test de fonction pulmonaire translational permettant une comparaison directe avec les données cliniques humaines. Cette approche soutient la caractérisation phénotypique des modèles de maladies pulmonaires et renforce la confiance prédictive dans la validation préclinique des cibles. La simplicité et la reproductibilité de la méthode facilitent son intégration dans les flux de travail de découverte pour la détection mécanistique des risques et le tri des portefeuilles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier des hypothèses thérapeutiques en quantifiant la perte de la fonction pulmonaire dans des modèles d'emphysème, de fibrose, de lésion pulmonaire aiguë et d'infection.
- Valeur opérationnelle : Fournit un dosage rapide et reproductible pour la validation fonctionnelle de cibles dans des études de pathologie pulmonaire chez la souris.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des données quantitatives basées sur les échanges gazeux, adaptées à l'analyse des effets de composés sur la structure et la fonction pulmonaires.
- Valeur opérationnelle : Une procédure standardisée avec un résultat en moins d'une minute permet un criblage phénotypique à haut débit dans les séries de découverte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur les mesures de la capacité de diffusion humaine, permettant une concordance des biomarqueurs entre espèces et une continuité translationnelle.
- Valeur opérationnelle : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en détectant les changements fonctionnels précoces dans les modèles précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs et aux tests d'efficacité préclinique, offrant un pont phénotypique entre les modèles murins et les critères d'évaluation cliniques humains.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies biologiques en détectant les modifications structurelles du poumon à l’aide de paramètres fonctionnels d’échanges gazeux.
- Dépistage : Permet la préparation des tests grâce à une collecte standardisée de gaz et à une analyse chromatographique de l’absorption du néon et du monoxyde de carbone.
- Analyse : Génère des valeurs quantitatives de la capacité de diffusion (DFCO) permettant de comparer la fonction pulmonaire entre différentes conditions expérimentales et différents points temporels.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les phénotypes murins et la pertinence clinique humaine par la comparabilité directe des mesures de capacité de diffusion.
- Réutilisation institutionnelle : Constitue une capacité réutilisable pour la surveillance longitudinale de la fonction pulmonaire dans divers modèles de maladies et phases d’étude.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique des modèles de pathologie pulmonaire grâce à une phénotypage quantitatif.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité par un protocole rapide comprenant l'injection de gaz, une apnée et une analyse par chromatographie en phase gazeuse.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant dès les premiers stades des indicateurs fonctionnels pertinents sur le plan translationnel, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des composés fondée sur le risque, en fonction de la préservation ou de l'amélioration de la fonction pulmonaire dans les modèles de maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en anesthésie murine, canulation trachéale et techniques de manipulation des gaz.
- Dépend de l'accès à un chromatographe en phase gazeuse étalonné équipé d'une colonne tamis moléculaire et d'un gaz vecteur hélium.
- Implique une standardisation interéquipes des volumes de gaz, des délais d'insufflation et des protocoles de dilution des échantillons.
- Requiert des adaptations selon qu'il s'agit de souriceaux ou de souris adultes, en raison de la taille pulmonaire et des volumes de gaz nécessaires (0,4 mL contre 0,8 mL).
- Comprend des limites pratiques telles que la nécessité d'éviter la contamination des échantillons lors du transfert, ainsi que l'importance d'une insufflation/décompression pulmonaire rapide pour des mesures précises.
