Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser la technologie de consommation d’oxygène basée sur des microplaques pour évaluer la fonction de la chaîne de transport d’électrons, de la voie d’oxydation bêta du cycle du TCA et des transporteurs de substrat. Pour ce faire, il faut d’abord préparer le substrat et les solutions d’injection pour le dosage. La deuxième étape consiste à ajouter les solutions d’injection dans une cartouche de dosage tric préalablement hydratée pour calibrer la machine de consommation d’oxygène.

Ensuite, préparez les solutions de substrat mitochondrial et chargez ces solutions dans la plaque de culture cellulaire. Faites tourner la plaque de culture cellulaire pour permettre l’adhérence mitochondriale à la plaque bien avant de charger la plaque dans le test métrique Respira. Les résultats de l’instrument sont obtenus qui montrent les taux de consommation d’oxygène basés sur la respiration mitochondriale pour chaque test respiratoire métrique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’électrode de Clark, est que les technologies basées sur des microplaques permettent une acquisition plus efficace et plus rapide de la consommation d’oxygène avec de plus petites quantités de mitochondries, généralement les personnes novices dans cette méthode auront du mal à cause de toutes les pièces mobiles impliquées dans la préparation des solutions pour le test La nuit précédant l’expérience Hydrate tric dose cartouche dans un millilitre de solution d’étalonnage dans un non Couveuse à CO2 à 37 degrés Celsius le lendemain, sortez toutes les tiges congelées et décongelez-les dans un bain ou un incubateur à 37 degrés Celsius. Préparez toutes les solutions de substrat et les solutions d’injection et stockez-les sur de la glace. L’étape suivante consiste à programmer la machine de mesure de la consommation d’oxygène multi-puits selon le poids de mélange et les paramètres de mesure appropriés.

Entrez dans le logiciel d’analyse et sélectionnez le mode standard. Entrez dans le forum des invités de l’hippocampe et cliquez sur l’assistant de test. Une fois dans l’assistant de test, cliquez sur protocole pour modifier le poids du mélange et les paramètres de mesure.

Étiquetez les puits d’arrière-plan sous l’onglet de correction arrière et assurez-vous de les mettre en surbrillance. Effectuez une correction d’arrière-plan. Étiquetez les conditions en cliquant d’abord sur l’onglet Groupes et étiquettes, puis sur l’onglet Informations sur le groupe.

Une fois ces paramètres saisis, cliquez sur Terminer, puis sur Enregistrer le modèle. Pour commencer cette procédure, chargez les solutions d’injection dans une cartouche de dosage. Prenez soin d’injecter les solutions dans les ports appropriés.

Chargez la cartouche de test dans la machine avec un coin cranté en bas à gauche. Démarrez l’étalonnage en entrant d’abord dans le logiciel d’analyse, puis en passant en mode standard. Entrez dans le forum des invités de l’hippocampe.

Ouvrez le modèle enregistré sous le lecteur XF sous l’onglet Modèles. Une fois ouvert, cliquez sur démarrer pour commencer l’étalonnage, qui prendra environ 30 minutes. Les mitochondries de cette procédure ont été isolées du muscle squelettique rouge en mélangeant doucement mais soigneusement le stock de substrat mitochondriale en remuant doucement, en itérant la solution avec une pointe de pipette de 200 microlitres dont l’extrémité a été coupée d’environ trois millimètres.

Après avoir déterminé la concentration en protéines du stock mitochondrial, les résus mettent en suspension 10 microgrammes de protéines mitochondriales pour 200 microlitres du mélange de substrat connu pour la pourriture succinale. Mélangez la solution de substrat de mitochondries doucement mais soigneusement en remuant doucement, en tapotant la solution avec une pointe de pipette de 200 microlitres dont l’extrémité a été coupée de la même manière à environ trois millimètres de son extrémité. Bande de Reeses, 14 microgrammes de protéines mitochondriales pour 200 microlitres de chacun des mélanges de substrats restants placent tous les mélanges de substrats de protéines mitochondriales sur de la glace.

Placez une plaque de culture cellulaire de 24 puits sur de la glace et en triple charge de 50 microlitres par puits de chacun des mélanges de substrats de mitochondries. Les développeurs du test trique basé sur des microplaques recommandent de laisser un minimum de deux puits vierges sans mitochondries, de préférence de chaque côté de la plaque de culture cellulaire. Faites tourner la plaque de culture cellulaire à 2000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour faire adhérer les mitochondries aux puits pendant que la plaque tourne.

Réchauffez les solutions de substrat dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois le spin terminé, chargez soigneusement 450 microlitres de chaque solution de substrat sur le dessus de ses puits respectifs. Assurez-vous de charger la plaque à température ambiante.

Chargez les puits vierges avec 500 microlitres de substrat brut. Les puits désignés pour l’essai de flux d’électrons doivent être chargés avec le substrat d’écoulement d’électrons, tandis que les puits vierges d’essai couplés peuvent être chargés avec n’importe quel substrat d’essai de couplage. Après avoir ajouté 450 microlitres de substrat à chacun, visualisez bien la couche de mitochondries dans le puits à un grossissement de 20 x pour vous assurer que les mitochondries sont dispersées uniformément dans une seule monocouche.

Comme le montre cet exemple, les puits d’image qui ne semblent pas avoir une monocouche uniformément répartie peuvent être supprimés après oc. Après avoir confirmé l’adhérence mitochondriale, apportez la plaque de culture cellulaire à l’instrument de test métrique Respir. Cliquez sur OK.

La machine éjectera la plaque utilitaire qui a été utilisée précédemment pour l’étalonnage. Retirez la plaque utilitaire et placez la plaque de culture cellulaire qui contient les mitochondries sur le plateau. L’encoche bleue sur la plaque de culture cellulaire doit être placée dans le coin inférieur gauche du plateau.

Cliquez sur Continuer pour démarrer le cycle de test, qui prend environ 40 minutes. Une fois l’exécution terminée, appuyez sur eject sur l’écran pour éjecter la plaque de culture cellulaire. Une fois la plaque éjectée, retirez et jetez la plaque de culture cellulaire et la cartouche.

Appuyez sur Continuer à l’écran. L’exécution sera automatiquement enregistrée sous forme de fichier XLS dans le fichier de données. Ouvrez ce fichier et changez l’affichage de O2 à OCR en appuyant sur la flèche vers le bas sous le marqueur Y.

Ensuite, modifiez le point médian pour les taux de point à point sous les données de taux affichées en option. Cliquez sur OK. Pour appliquer ces modifications, cliquez sur l’onglet Mode de groupe de puits en bas à gauche de l’écran pour regrouper les puits de conditions similaires.

Enfin, cliquez sur l’onglet de l’échantillon d’erreur standard moyenne vers le milieu de l’écran à gauche. Ces commandes pourraient également être configurées avant le test. Ces tracés représentent les taux de consommation d’oxygène ou OCR en fonction du temps pour quatre tests de couplage.

Le premier panneau représente l’état deux, la respiration ou la respiration en l’absence de DP. Le deuxième panneau après l’injection d’un DP représente la respiration couplée maximale, également appelée respiration d’état trois. Le troisième panneau après injection d’oligomycine. A représente la respiration due à une fuite de protons, également appelée respiration d’état quatre.

Le quatrième panneau après l’injection de FCCP représente la respiration découplée maximale, également appelée respiration d’état trois U. Le cinquième panneau après injection d’antimycine A représente l’inhibition de la respiration oxydative. Tous les états mitochondriaux ont un écart-type minimal en raison du mélange minutieux du stock mitochondrial et des mélanges de substrats mitochondriaux et de l’obtention d’une seule monocouche de mitochondries après le spin d’adhérence.

En revanche, le fait de charger des mitochondries inégales dans chaque puits et de ne pas atteindre une seule monocouche de mitochondries entraîne une augmentation de l’écart-type dans chaque état, comme l’indique la trace bleue, qui montre des valeurs OCR supérieures à 1 500 ole par minute, ainsi qu’une diminution des taux de respiration au cours de la période de mesure, illustrée par la baisse des valeurs de taux point par point. Notez que le tracé rouge affiche des taux de point à point cohérents et que les valeurs maximales d’OCR sont inférieures à 1 500 ole par minute. La surcharge en protéines mitochondriales peut également entraîner l’épuisement de l’oxygène dans la micro-chambre du puits, empêchant ainsi une mesure précise de l’OCR pour chaque mesure successive, comme l’indique la trace bleue, qui montre des valeurs d’O2 proches de zéro pendant la période de mesure, ainsi que des valeurs d’O2 de départ considérablement réduites après chaque mesure successive.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir des patients lors du mélange des mitochondries et des solutions de substrat. Une fois ces méthodes maîtrisées, des expériences supplémentaires peuvent être déformées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : comment les traitements ciblés d’un certain transporteur de substrat influencent-ils la consommation d’oxygène mitochondrial ?