Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de nouveaux gènes candidats pour les troubles malformateurs cérébraux et de confirmer directement leur rôle causal in vivo. Cette stratégie peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie en découvrant des voies moléculaires associées au développement du cerveau et aux pathologies corrélées. Le principal avantage de cette stratégie est qu’elle permettra de découvrir de nouveaux gènes associés aux troubles cérébraux et de développer de nouveaux outils de diagnostic.

En utilisant cette approche, nous avons pu révéler la contribution cruciale du gène C6orf70 dans la pathogenèse de l’hétérotopie nodulaire périventriculaire, une malformation cérébrale causée par une migration neuronale anormale. Fabienne Schaller, une ingénieure de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Préparez une rat enceinte E15 pour la procédure décrite dans le protocole écrit et conformément aux directives institutionnelles et nationales.

Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié, qu’une pommade ophtalmique est appliquée sur les yeux et que l’abdomen est correctement rasé et désinfecté. Après avoir utilisé des ciseaux tranchants pour faire une incision verticale de deux centimètres dans la peau et le muscle de la ligne médiane de l’abdomen caudal, exposez soigneusement une corne utérine de la cavité abdominale. Appliquez une solution saline normale préchauffée à 37 degrés Celsius goutte à goutte pour hydrater les embryons.

Gardez l’utérus humide tout au long de la procédure. Pour injecter de l’ADN, tenez doucement un embryon dans une main avec la tête facilement accessible. Ensuite, à l’aide de l’autre main, insérez soigneusement un capillaire en verre relié à un micro-injecteur dans le ventricule latéral gauche situé à un millimètre de la ligne médiane et à une profondeur de deux à trois millimètres.

Utilisez le micro-injecteur pour injecter environ un microlitre d’ADN avec du vert rapide pour permettre un suivi visuel de l’injection. Pour électroporer l’ADN dans les cellules, déposez d’abord une solution saline normale à la surface de l’électrode de trois millimètres sur sept. Placez ensuite l’électrode positive sur le côté injecté et l’électrode négative sur le ventricule droit non injecté.

Utilisez la pédale commandée au pied pour délivrer cinq impulsions électriques à des intervalles de 950 millisecondes. Après l’électroporation, renvoyez la corne utérine dans la cavité abdominale et ajoutez une solution saline stérile pour permettre aux embryons de se positionner plus naturellement et pour tenir compte de la perte de liquide peropératoire. Fermez la paroi musculaire à l’aide de sutures chirurgicales résorbables, puis la peau à l’aide d’un simple point interrompu.

Fournir une analgésie postopératoire jusqu’à 48 heures ou selon les directives de l’établissement. Remettez le rat dans sa cage propre et surveillez-le jusqu’à ce qu’il sorte de l’anesthésie. Après avoir fixé les cerveaux dans du paraformaldéhyde à 4 % comme indiqué dans la partie écrite du protocole, laver au PBS pendant 10 minutes.

Pendant le lavage, préparez 50 millilitres de gélose à 4 % dans du PBS en veillant à ce que la température de l’agarose dissoute ne dépasse pas 50 degrés Celsius. Versez l’agarose dans des moules d’enrobage en plastique, puis placez les cerveaux dans l’agarose. Placez les cerveaux encastrés à quatre degrés Celsius et laissez l’agarose polymériser pendant au moins une heure.

Une fois que l’agarose a polymérisé, coupez l’excès d’agarose autour du cerveau, puis collez le cerveau à la plaque de base du vibratome avec l’accès antérieur et postérieur du cerveau perpendiculaire à la lame. Après avoir attendu quelques minutes que la colle sèche, placez la plaque avec le cerveau collé dans la chambre du vibratome. Remplissez le vibratome de PBS et commencez à trancher des sections de 100 microns d’épaisseur.

Après la section, transférez les sections sur des lames de microscope et retirez l’excès de liquide. Ajoutez ensuite quelques gouttes de support de montage et placez une lamelle sur le dessus des sections. Laisser sécher toute la nuit.

Imagez les coupes à l’aide d’un grossissement de 10x sur un microscope confocal à balayage laser. Pour analyser les images, convertissez d’abord l’image en 8 bits à l’aide d’un logiciel approprié pour l’analyse quantitative des images. Sélectionnez ensuite une cellule fluorescente positive GFP représentative et définissez manuellement sa forme en cliquant sur estimer et en utilisant l’outil de sélection à main levée pour dessiner la bordure de la cellule.

Le logiciel conserve automatiquement le diamètre et le seuil d’intensité de la cellule. Cliquez sur trouver des cellules pour permettre au logiciel de localiser les cellules transfectées dans tout le cortex. Ensuite, si nécessaire, supprimez manuellement les faux positifs.

Divisez toute l’épaisseur du cortex en huit zones d’intérêt, normalisées en sections individuelles, en cliquant sur l’outil de région, en sélectionnant huit bandes de région, où les bandes un et huit correspondent respectivement à la zone ventriculaire et au sommet de la plaque corticale. Ensuite, cliquez sur appliquer pour permettre au logiciel de compter la position relative des cellules transfectées de GFP dans l’ensemble du cortex. Enfin, cliquez sur enregistrer la quantification pour exporter les données dans un fichier Excel à des fins d’analyse.

Le séquençage de la CGH et de l’exome entier a permis d’identifier C6orf70 comme un gène candidat pour les anomalies génétiques du développement. La PCR quantitative a déterminé que ce gène, ainsi que PHF10 et DLL1, sont exprimés dans le cortex cérébral du rat. Les images suivantes montrent des coupes coronales néocorticales représentatives de cerveaux de rats E20 5 jours après l’électroporation avec soit une construction de protéine fluorescente verte seule, soit combinée à un shRNA ciblant la séquence codante C6orf70 ou à la construction de mésappariement relativement inefficace.

Le filament A a été utilisé comme contrôle de la migration neuronale altérée. L’électroporation in utero avec shRNA ciblant le C6orf70 ou le filament A a induit l’arrêt des cellules positives à la GFP dans la zone ventriculaire, comme l’indiquent les flèches blanches, tandis que les cellules exprimant la GFP seule, ou en combinaison avec la construction de mésappariement, n’ont pas modifié la migration neuronale. Lors de cette procédure, il est important de garder à l’esprit l’état de la genèse corticale que vous souhaitez analyser, soit la prolifération neuronale, la migration ou la maturation.

N’oubliez pas qu’apprendre à effectuer l’électroporation in utero dans le cerveau embryonnaire de rongeur nécessite une longue période d’entraînement, des compétences et une pratique régulière.