La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l'eau par Salvi TOF-SIMS

L'objectif général de cette procédure est de caractériser les films de protéines adsorbées en solution aqueuse, en utilisant le système d'analyse à l'interface liquide-vide et la spectrométrie de masse d'ions secondaires par temps de vol. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les biomolécules et l'interface biologique. Par exemple, la caractérisation des protéines adsorbées sur une surface solide.

Les principaux avantages de cette technique sont que les biomolécules peuvent être analysées in situ dans un environnement liquide, et en combinaison avec une cartographie moléculaire. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les biomolécules à l'interface solide-liquide, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, notamment l'étude de cellules cancéreuses isolées, des interactions médicamenteuses et l'attachement de biofilms. Dans une seringue de cinq millilitres, prélevez deux millilitres d'une solution d'éthanol à 70 %.

Connectez la seringue à l'extrémité d'entrée du dispositif SALVI et injectez lentement un millilitre de liquide sur une période de 10 minutes. À la fin de l'injection, retirez la seringue et reliez l'entrée et la sortie du SALVI à l'aide d'un raccord en polyéther-céto-éther. Maintenez le microcanal SALVI rempli de la solution d'éthanol à 70 % à température ambiante pendant quatre heures.

Ensuite, remplir une deuxième seringue avec de l'eau stérile déionisée. La connecter à l'entrée du SALVI et injecter lentement l'eau déionisée dans le dispositif sur une période de 10 minutes. Retirer la seringue, puis reconnecter ensemble l'entrée et la sortie du dispositif.

Afin d'immobiliser un film protéique, commencez par aspirer deux millilitres de solution de fibronectine dans une seringue. Connectez la seringue à l'entrée du dispositif SALVI et injectez lentement un millilitre du liquide sur une période de 10 minutes. Ensuite, retirez la seringue, puis reconnectez à nouveau l'entrée et la sortie.

Incuber le dispositif dans une boîte de culture propre à température ambiante pendant 12 heures. Après l'incubation, injecter lentement un millilitre d'eau stérile désionisée sur une période de 10 minutes, puis reconnecter l'entrée à la sortie. Pour commencer, placer la platine ToF-SIMS sur une surface plane et propre.

Placez le dispositif SALVI sur la platine, avec la tranche de silicium et la membrane de nitrure de silicium orientées vers le haut. Fixez le dispositif SALVI à la platine à l’aide de quatre pièces métalliques de serrage, et vissez les pièces métalliques qui maintiennent les coins du dispositif dans la plaque métallique à l’aide de quatre vis. Ensuite, enroulez délicatement le tube en PFTE relié au canal microfluidique.

Utilisez quatre pièces métalliques et quatre vis pour maintenir la partie rigide en place. Assurez-vous que l'appareil est positionné dans l'espace libre sur la platine, de manière à ne pas gêner le faisceau d'ions primaire pendant l'analyse. Ensuite, fixez la cupule de Faraday sur la platine à l'aide d'une vis.

Ensuite, ouvrez la porte du sas de chargement ToF-SIMS et placez horizontalement la platine sur la plateforme de chargement avant de refermer la porte. Mettez en marche la pompe à vide et laissez le sas atteindre une pression d'environ 10 à la puissance moins six millibars. Puis, après environ 30 minutes, une fois le vide stabilisé, déplacez le dispositif SALVI dans la chambre principale.

Réglez le faisceau d'ions primaire et l'analyseur du SIMS à temps de vol (ToF-SIMS) afin d'obtenir une résolution spatiale d'environ 400 nanomètres, en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Ensuite, localisez le canal microfluidique à l'aide du microscope optique. Utilisez le centre de l'image optique comme référence et alignez-le de manière à ce qu'il coïncide avec le centre de l'image des ions secondaires.

La démonstration visuelle de cette étape est essentielle, car elle est difficile à apprendre, la préparation étant plus épaisse que les échantillons solides habituels, et il est difficile de régler les paramètres pour obtenir la meilleure mise au point du canal. Avant chaque mesure, utilisez un faisceau d'oxygène d'un kiloélectronvolt pour balayer la fenêtre de nitrure de silicium pendant environ 15 secondes afin d'éliminer les contaminants de surface. Utilisez également un canon à électrons de compensation pour neutraliser la charge de surface pendant toutes les mesures.

Ensuite, sélectionnez le mode positif ou négatif avant de commencer l'acquisition des données. Utilisez le faisceau d'ions primaires bismuth trois plus de 25 kiloelectronvolt pour toutes les mesures. Pour le profil en profondeur, balayez le faisceau d'ions primaires sur une zone circulaire d'un diamètre d'environ deux micromètres avec une résolution de 32 pixels par 32 pixels.

Pour réduire au minimum le temps nécessaire pour percer la membrane de nitrure de silicium, utilisez un faisceau d'ions primaires à large largeur d'impulsion. Après la perforation de la membrane de nitrure de silicium, maintenez le même courant pendant environ 200 secondes afin d'obtenir suffisamment de données pour des reconstructions d'images bidimensionnelles. Pour la collecte des données, réduisez la largeur d'impulsion à 80 nanosecondes afin d'acquérir des spectres présentant une meilleure résolution de masse.

Poursuivez cette acquisition pendant environ encore 200 secondes. À l’aide de l’interface microfluidique SALVI, le faisceau d’ions primaires peut bombarder directement le film de fibronectine hydraté. Un certain nombre d’agrégats d’eau et de fragments d’acides aminés sont indiqués par les données de spectrométrie de masse ToF-SIMS.

Ceci fournit une preuve directe de la propriété des molécules d'eau entourant et situées à l'intérieur des molécules de protéines hydratées. Ici, on peut observer la série temporelle du profil en profondeur du film de fibronectine hydratée et de l'eau déionisée. Les intensités des ions secondaires sélectionnés sont négligeables avant que la membrane de nitrure de silicium ne soit percée.

Une fois que la membrane de nitrure de silicium est percée, les intensités des ions secondaires augmentent considérablement. Le procédé à courte durée d'impulsion est utilisé pour obtenir des données présentant une meilleure résolution de masse pour les reconstructions d'images et de spectres. Les images 2D du film de fibronectine hydraté et de l'eau déionisée représentent les nombres de comptages d'ions secondaires sélectionnés provenant de l'échantillon.

Plus l'image est lumineuse, plus le nombre d'ions secondaires est élevé. Ces images intuitives permettent une comparaison claire des ions secondaires sélectionnés entre différents échantillons, ce qui est utile lors de l'analyse des données. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'un microréacteur doit être étanche avant d'être installé dans la chambre à vide.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie et des biointerfaces pour explorer l'adsorption des protéines, l'attachement des biofilms, les monocouches auto-assemblées à la surface, et de nombreux autres phénomènes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier divers échantillons liquides à l'aide de SALVI et du ToF-SIMS en phase liquide.