Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

L'objectif général de cette méthode est de permettre la réalisation d'expériences de sauvetage par épuisement dans des conditions qui préservent l'intégrité cellulaire et l'homéostasie des protéines, afin d'effectuer des analyses fonctionnelles de processus biologiques au niveau de la cellule unique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les fonctions des protéines et les exigences structurales dans la dynamique cellulaire, comme la mitose et la différenciation cellulaire. Le principal avantage de cette technique est d'épuiser une protéine d'intérêt tout en réintroduisant simultanément une variante de cette protéine à un niveau proche du niveau physiologique dans la majorité d'une population cellulaire.

Commencez par recouvrir des boîtes à fond en verre avec de la fibronectine. Pour ce faire, diluez un stock de fibronectine à un milligramme par millilitre au 1/100 avec du PBS stérile.

Ajouter un millilitre dans chaque boîte de 35 millilitres pour recouvrir toute la surface. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pendant l'incubation, préchauffer l'alpha MEM complété avec 10 % de FBS et un aliquot de 0,05 % de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius.

Après 45 minutes d'incubation, commencez à préparer la solution cellulaire. Aspirez le milieu d'une plaque de 10 centimètres de cellules HeLa-RFP-H2B. Et rincez doucement deux fois avec 1,5 millilitre de trypsine-EDTA à 0,05 %.

Laisser 0,5 millilitre de trypsine-EDTA sur la plaque après le dernier prélèvement et incuber les cellules de deux à trois minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Tapotez doucement la plaque et observez la couche cellulaire au microscope pour vérifier que toutes les cellules ont été détachées. Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu et pipetez doucement plusieurs fois pour dissocier les cellules, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Compter un échantillon de 10 microlitres de la suspension cellulaire à l'aide d'un hématimètre. Ensuite, aspirer la solution de fibronectine des boîtes à fond en verre. Ne pas laisser sécher la fibronectine avant la mise en place des cellules.

Préparer une solution de suspension cellulaire pour ensemencer 1,5 × 10⁵ cellules par boîte de 35 millimètres dans deux millilitres de milieu. Ensemencer une boîte de 35 millimètres supplémentaire par rapport au nombre de conditions afin de dénombrer le nombre de cellules avant la transduction virale. Incuber de 30 à 45 minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, examiner les cellules au microscope pour s'assurer qu'elles sont bien séparées, comme illustré ici. Remettre les boîtes dans l'incubateur et laisser les cellules croître jusqu'au lendemain.

Le jour suivant la mise en culture, vérifiez que les cellules ont atteint une densité d'au moins 50 %. Une densité cellulaire inférieure à 50 % entraîne une efficacité réduite de la transduction virale, une variation accrue de l'expression protéique par cellule et une toxicité cellulaire augmentée. Ensuite, récoltez les cellules à partir de la boîte supplémentaire mise en culture comme précédemment et déterminez le nombre de cellules. Calculez le volume de virus nécessaire pour une transduction efficace des cellules. Étiquetez un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour chaque condition, puis ajoutez 400 microlitres d'alpha MEM chaud sans sérum. Après avoir décongelé lentement les aliquots de virus sur de la glace, ajoutez le volume requis de chaque virus dans les tubes et mélangez délicatement à l’aide d’une pipette. Ensuite, après avoir aspiré le milieu des cellules, ajoutez doucement le mélange viral goutte à goutte. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. Toutes les 15 minutes pendant une heure, agitez soigneusement les boîtes sous la hotte stérile afin de recouvrir uniformément les cellules avec le virus. L’utilisation d’une faible quantité de milieu facilite le contact entre le virus et les cellules.

Après l'incubation, pipeter doucement 1,6 millilitre de alpha MEM moins dans chaque plaque afin d'obtenir un volume total de deux millilitres. Ensuite, commencer la synchronisation cellulaire en ajoutant de la thymidine à deux millimolaire avant d'incuber les cellules pendant deux heures supplémentaires.

Entre-temps, préparez le mélange de transfection d'ARNsi en ajoutant dans un microtube 139 microlitres d'eau stérile, 50 microlitres de chlorure de calcium à une molaire et 11 microlitres d'ARNsi à 20 micromolaire. Si aucun ARNsi n'est nécessaire, remplacez la quantité d'ARNsi par de l'eau stérile afin d'effectuer une transfection vide. Ajoutez lentement, goutte à goutte, la solution HBSS-2X au mélange de chlorure de calcium et d'ARNsi. Mélangez doucement deux fois par injection d'air à l'aide d'une pipette de 200 microlitres, car des précipités plus petits entraînent une efficacité de transfection supérieure. Incubez ensuite le mélange pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajoutez lentement 200 microlitres goutte à goutte à chaque plaque et agitez pour homogénéiser. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 heures.

Le lendemain, retirez les boîtes de l’incubateur et transportez-les dans une hotte de culture tissulaire. Après avoir lavé les cellules deux fois avec deux millilitres de HEPES chaud, ajoutez deux millilitres d'alpha MEM sans avant de les remettre dans l’incubateur.

Sept heures plus tard, ajoutez deux millimoles par litre de thymidine dans les plaques avant de les remettre dans l'incubateur. Manipulez au maximum quatre plaques cellulaires à la fois, car les variations de température affectent la durée du cycle cellulaire. Le jour suivant, 48 heures après la transfection par ARNsi et l'infection virale, rincez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS chaud, puis ajoutez deux millilitres d'alpha MEM sans rouge de phénol pour l'imagerie de cellules vivantes. Incubez pendant sept heures.

Réalisez des expériences d'imagerie vivante à court terme sur des cellules en mitose à l'aide d'un microscope inversé équipé d'une chambre humidifiée régulée en température et en dioxyde de carbone (5 %). Avant l'acquisition, vérifiez que la chambre a atteint la température appropriée de 37 degrés Celsius.

Placer les boîtes de culture dans la chambre du microscope une heure avant l'acquisition afin de permettre une équilibration adéquate du milieu et d'éviter les dérives de mise au point dues aux changements de température. Examiner le statut mitotique des cellules. À ce stade, 10 à 15 % des cellules doivent se trouver dans les premières phases de la mitose.

Pendant le temps d'équilibre, configurez les paramètres d'acquisition déterminés lors des expériences précédentes. Il est important d'obtenir une résolution adéquate sans photoblanchiment, car cela endommage les cellules et perturbe la progression mitotique. Sélectionnez plusieurs champs contenant des cellules en entrée mitotique par condition afin d'obtenir un nombre significatif de cellules à analyser sans dépasser l'intervalle d'acquisition. Une fois tous les champs choisis, réinitialisez le focus et démarrez l'acquisition le plus rapidement possible.

À l’aide d’un système confocal à disque rotatif, un montage typique comprendrait quatre conditions différentes, sept champs par plaque et deux canaux de couleur avec un intervalle de 1,5 à deux minutes sur une période de 75 minutes. Définir des critères bien précis pour analyser les phénotypes mitotiques dans les cellules, ce qui dépendra des marqueurs fluorescents utilisés.

Contrairement à la transfection de BAG3-GFP par ADN plasmidique, comme indiqué à gauche, l'adénofection avec des adénovirus recombinants, illustrée ici à droite, permet une expression plus homogène et plus efficace de BAG3-GFP, dans la majorité de la population cellulaire à faible multiplicité d'infection. Ce western blot représentatif montre que l'adénofection avec des ARNsi spécifiques de BAG3 et l'adénovirus recombinant BAG3-GFP permet une déplétion efficace du BAG3 endogène et une réintroduction de la protéine BAG3-GFP à des niveaux proches des niveaux endogènes. Comme illustré ici, l'adénofection peut préserver l'homéostasie protéique, car aucune augmentation détectable des niveaux des protéines de choc thermique induites par le stress n'est observée dans les cellules HeLa ayant subi une adénofection, contrairement aux cellules HeLa traitées avec l'inducteur de stress protéotoxique MG132. Ici, nous observons que la progression des cellules en mitose n'est pas significativement perturbée par l'adénofection, comme le montrent ces images en microscopie confocale en laps de temps de cellules HeLa adénofectées avec un ARNsi contrôle et BacMam-GFP alpha Tubuline, ainsi que BacMam-RFP Actine.

Le graphique indique la proportion de cellules présentant une mitose anormale. Les cellules adénofectées uniquement avec un ARNi spécifique de BAG3 ont montré une augmentation d'environ deux fois du taux de défauts mitotiques, comme illustré par la barre rouge, qui a été rétabli à un niveau proche de celui des cellules témoins par la réintroduction de BAG3-GFP, représentée par la barre noire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des expériences de complémentation fonctionnelle après épuisement par adénofection. Cette méthode offre un système rapide et simple pour créer des diminutions hypomorphes afin d'effectuer des analyses structure-fonction dans divers contextes cellulaires. En suivant cette approche, il est possible d'identifier les exigences structurales essentielles du protéine d'intérêt pour une fonction donnée. D'autres méthodes d'édition du génome peuvent ensuite être utilisées pour approfondir les mécanismes impliqués.