Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement

L’objectif général des techniques suivantes est de former des chercheurs débutants pour travailler avec Streptomyces et d’autres espèces apparentées dans les laboratoires d’enseignement universitaire et les salles de classe des écoles secondaires. L’observation phénotypique est importante pour les nombreux chercheurs qui entrent dans le domaine de la recherche sur les streptomyces. Cette vidéo décrit les méthodes de propagation bactérienne, d’entreposage et d’examen visuel et microscopique.

Les méthodes de phénotpy décrites ici utilisent Streptomyces coelicolor comme modèle. Cependant, les méthodes sont applicables à tous les membres du grand genre ainsi qu’aux Actinomyces étroitement apparentés. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont conçues pour être accessibles aux chercheurs novices dans une salle de classe de lycée ou un laboratoire d’enseignement de premier cycle, ainsi qu’au personnel de laboratoire expérimenté.

Après avoir regardé cette vidéo et lu le protocole qui l’accompagne, les nouveaux chercheurs devraient être en mesure de manipuler leurs souches de Streptomyces, de les stocker correctement et de commencer des expériences de caractérisation visuelle. Garret Kandell et Sean Kirk, étudiants de premier cycle en recherche de mon laboratoire à l’Université Otterbein, feront la démonstration des procédures. Pour commencer, il faut utiliser une méthode standard, comme la méthode des traînées de quadrants démontrée dans Saunders (2012), qui consiste à tracer des souches de Streptomyces sur des plaques de gélose MS et à les cultiver en colonies individuelles.

Tous les quatre à six jours, choisissez une seule colonie et réinstallez-la sur une assiette fraîche. Au fur et à mesure que les colonies vieillissent, elles deviennent sujettes à des mutations aléatoires. Après avoir effectué la mutagénèse selon le protocole de texte, notez la morphologie de la colonie pour chaque mutant par rapport à la souche parentale de type sauvage.

Lors de la caractérisation de nouvelles espèces de Streptomyces, comparez le nouvel isolat à celui d’une espèce bien étudiée en notant la forme de base, la surface de la colonie, l’opacité, l’élévation et la pigmentation. Étiquetez une plaque de gélose MS et striez les souches de type sauvage et mutantes en coins. Veillez à ce qu’aucune souche ne touche une autre souche pour éviter la contamination croisée.

Notez la date et l’heure auxquelles les souches sont striées sur la plaque. Ensuite, incubez les plaques à 30 degrés Celsius. N’oubliez pas qu’il est extrêmement important de toujours protéger votre échantillon de Streptomyces de la contamination.

Utilisez votre meilleure technique stérile pour toutes les étapes, en ouvrant les plaques et les tubes le moins de temps possible. Placez des boîtes de Pétri cultivées sur du papier coloré ou blanc pour homogénéiser l’arrière-plan. Écrivez sur le papier le nom de la souche, la date, la température d’incubation et le temps écoulé depuis la première traînée de plaques.

Prenez des photos numériques de la plaque avec les informations de déformation écrites sur le fond du papier afin que la confusion soit minimale. Stérilisez les pinces à épiler en les lavant avec de l’éthanol à 70 %, puis en les passant à travers une flamme de bec Bunsen pour évaporer l’éthanol. Stérilisez les lamelles en les lavant dans de l’éthanol à 70 %, puis en les laissant sécher dans une boîte de Pétri stérile.

Ensuite, pour préparer un soulèvement de la croissance bactérienne, utilisez une pince à épiler stérile pour ramasser une lamelle stérile et placez la lamelle sur une plaque de gélose MS où la croissance bactérienne est dense. À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur l’arrière de la lamelle pour assurer un transfert suffisant des spores bactériennes et du mycélium aérien. Prenez la lamelle de la plaque et placez-la à un angle de 45 degrés, le matériau de la cellule faisant face à la surface d’une lame de microscope contenant une goutte de 15 microlitres de glycérol à 50 %.

Laissez la lamelle tomber sur le glycérol, ce qui réduira les bulles d’air. Pour effectuer une microscopie à contraste de phase à différents intervalles de temps, placez la lame préparée sur la platine du microscope et ajoutez une goutte d’huile d’immersion au centre de la lamelle. Faites pivoter l’objectif de phase 100x en place et réglez la tourelle du condenseur sur le réglage de phase approprié.

Une fois que l’objectif est en contact avec l’huile, utilisez uniquement le bouton de réglage fin pour faire la mise au point de l’image. Examinez plusieurs champs de vision pour discerner des différences notables et constantes entre les souches mutantes et le type sauvage. Comme la capacité de former des spores, la taille et la forme des spores et le nombre total de spores.

À l’aide d’une pince à épiler stérile, préparer un soulèvement de lamelle à partir d’une plaque de gélose MS comme précédemment où la croissance bactérienne est évidente, touchant doucement l’arrière de la lamelle avec la pince à épiler pour assurer un transfert suffisant de spores bactériennes et de filaments aériens. Ramassez la lamelle de la plaque et placez-la sur du papier cartonné de sorte que le côté avec le matériau de la cellule soit vers le haut pour faciliter la manipulation de la lamelle. Avec du méthanol glacé, inondez la lamelle et laissez-la reposer pendant cinq minutes.

À l’aide de PBS, lavez la lamelle deux fois en distribuant doucement et en retirant la solution. Ajoutez 15 microlitres d’une solution d’iodure de propidium de 10 microgrammes par millilitre et/ou 10 microgrammes par millilitre de WGA-FITC sur une lame. Placez la lamelle face vers le bas sur une goutte de colorant fluorescent.

Incuber les échantillons dans une pièce sombre ou faiblement éclairée pendant 15 minutes. Les stocks de colorants fluorescents et les échantillons de colorants doivent être protégés de la lumière. Il est recommandé aux chercheurs d’utiliser des conditions de faible luminosité lors de la préparation des échantillons et d’utiliser une boîte sombre pour conserver les échantillons une fois qu’ils sont préparés.

Observez les lames sous une lentille d’objectif 100x à l’aide d’un microscope à contraste de phase ou DIC équipé de cubes d’excitation d’épifluorescence pour l’iodure de propidium et le FITC. Analysez les images selon le protocole texte. Voici des exemples de mutants de Streptomyces résultant de la mutagenèse par transposon.

Un mycélium aérien de couleur plus claire peut indiquer un niveau plus faible de pigment gris causé par un défaut de sporulation. Ou l’absence d’apparence floue est indicative d’un blocage dans la formation du mycélium aérien. Comme le montre la microscopie à contraste de phase, les colonies sauvages de S. coelicolor produisent généralement un mycélium aérien environ deux jours de croissance.

Et de longues chaînes de spores par trois jours de croissance. Les mutants blancs peuvent soit retarder la formation des spores, soit montrer une réduction de l’abondance des spores produites, soit produire des spores avec des défauts de forme et/ou de taille, soit simplement produire des niveaux plus faibles de pigment de spores matures et grises. Montré ici à l’aide de la microscopie DIC et de la microscopie à fluorescence avec coloration PI, la coloration régulièrement espacée d’une chaîne de spores dans un échantillon de type sauvage est comparée au modèle de coloration intermittente de deux mutants d’insertion de transposons qui présentent un défaut de ségrégation chromosomique.

L’utilisation de WGA-FITC pour colorer la paroi cellulaire de la souche sauvage S. venezuelae est présente sous forme de filaments aériens lisses parmi les chaînes de spores. Et présente l’ensemble latéral de septa de division que l’on observe généralement lors de la sporulation. Travailler avec un organisme filamenteux est très différent de travailler avec une bactérie bien connue, en forme de bâtonnet.

Les protocoles vidéo présentés ici devraient servir de ressource importante pour les nouveaux chercheurs qui entrent dans le domaine de la recherche sur les streptomyces. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de commencer à étudier les espèces de Streptomyces et d’autres bactéries apparentées. À la suite de ces premières expériences, diverses techniques peuvent être utilisées dans un laboratoire de recherche pour en savoir plus sur vos souches de Streptomyces.

Par exemple, certaines des techniques avancées peuvent être le marquage de protéines ou l’analyse de l’expression génique telle que la PCR en temps réel et le séquençage de l’ARN. Les expériences initiales de phénotypage sont utilisées pour identifier et caractériser de nouvelles souches et discerner le rôle typique d’un gène particulier. Ces méthodes ont déjà été utilisées dans des laboratoires d’enseignement universitaire pour identifier et caractériser une grande variété de souches de Streptomyces.