Utilisation de la diffusion améliorée par Nanoplasmon et imagerie microscopique à faible grossissement pour quantifier les exosomes dérivés de tumeurs

La diffusion nanoplasmonique améliorée, ou nPES, est une alternative simple et non invasive à la biopsie chirurgicale qui peut sauter des étapes de purification exosome longues et laboriculaires, élargissant l’application de l’analyse exosome aux arrangements cliniques. Cet essai nPES est une procédure rapide pour analyser des biomarqueurs spécifiques sur la membrane externe des exosomes qui ne nécessite pas d’étapes distinctes d’isolement et de purification. Nous avons seulement besoin d’un très petit échantillon clinique pour cet essai.

Par conséquent, cette méthode peut étendre l’utilisation du nPES à l’étude de modèles de souris génétiquement modifiés ou PDX. Il y a quelques étapes dans ce protocole qui peuvent sembler intimidantes. Cependant, avec quelques courses de pratique, tous ceux qui ont des compétences de base en laboratoire humide peuvent apprendre à effectuer avec succès nPES.

Pour commencer la procédure, combinez 40 microlitres d’une suspension de nanorods d’or fonctionnalisés par NeutrAvidin avec 200 microlitres de solution saline froide et tamponnée de pH sept. Centrifuger le mélange à 8500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, et enlever le surnatant. Répétez ce processus de lavage deux fois plus, puis résuspendez les nanorods dans 40 microlitres de PBS froid.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS froid et 10 microlitres d’une solution de 0,5 milligramme par millilitre des anticorps biotinylés appropriés à la suspension. Mélanger à quatre degrés Celsius pendant deux heures pour obtenir des nanorods d’or conjugués aux anticorps. Lavez les nanorods trois fois par centrifugation dans des portions de 200 microlitres de PBS froid à 6500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes chacune.

Par la suite, resuspendez les nanorods conjugués aux anticorps lavés dans 200 microlitres de PBS froid, et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à 24 heures. Pour commencer à préparer la diapositive, diluer les anticorps de capture exosome désirés à 025 milligrammes par millilitre dans PBS. Pipette un microlitre de cette solution dans chaque puits d’une protéine A / G traitée diapositive soutenue avec du verre de qualité optique.

Ensuite, transférez la lame dans une boîte humidifiante pour vous assurer que les puits ne se dessèchent pas pendant l’incubation. Incuber la glissade à 37 degrés Celsius pendant une heure pour immobiliser les anticorps de capture. Ensuite, aspirez la solution restante pour éliminer les anticorps non liés.

Lavez les puits en ajoutant et en aspirant trois fois un microlitre de PBS. Ensuite, chargez rapidement chaque puits avec un microlitre de tampon de blocage à base de PBS, et incuber la glissière à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Lors de l’exécution d’environ 15 échantillons, nous devons utiliser une pipette à canal unique pour charger le tampon bloquant sur 120 puits en moins de cinq minutes pour éviter l’évaporation de l’agent bloquant.

Commencez à préparer une solution de nanorods d’or conjugués aux anticorps pendant le blocage des glissières. Environ 30 minutes avant la fin du blocage, décongelez rapidement des échantillons de plasma ou de sérum dans un bain d’eau à température ambiante. Vortex les échantillons décongelés pendant 30 secondes pour s’assurer que les suspensions sont homogènes.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 500 fois g pendant 15 minutes pour précipiter les agrégats de protéines et d’autres débris. Transférez des aliquots de 10 microlitres du supernatant sur des tubes frais et faites des dilutions en tête-à-tête avec PBS. Mélanger les échantillons dilués par vortex doux ou inversion le cas échéant.

Lorsque le blocage des glissières est terminé, aspirez le tampon de blocage et lavez les puits trois fois avec des portions d’un microlitre de PBS. Chargez immédiatement les échantillons dans les puits avec un microlitre par puits et huit répliques par échantillon. Chargez les normes exosome dans les puits appropriés de la même manière.

Incuber la lame de 12 à 18 heures au réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez les puits et lavez-les une fois avec un microlitre de PBS. Chargez un microlitre de la suspension nanorod or conjuguée aux anticorps dans chaque puits et incubez la glissière à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, aspirer la suspension nanorod, et laver la lame en PBS complétée par 1% polysorbate 20 pendant 10 minutes à l’aide d’un mélangeur. Ensuite, aspirez les puits et lavez la lame dans de l’eau déionisée pendant 10 minutes sur un mélangeur rotatif. Retirer l’eau et laisser sécher à l’air libre dans une boîte de Pétri propre avant d’amener la lame au microscope à champ foncé.

Installez un microscope inversé équipé d’un condenseur d’immersion d’huile en champ sombre, d’un objectif 4x et d’un stade motorisé. Connectez le microscope à un ordinateur via un appareil photo numérique et ouvrez le logiciel d’imagerie. Ensuite, placez la glissière de l’échantillon à l’envers sur l’étape du microscope, et appliquez une petite goutte d’huile d’immersion où la lentille du condenseur entre en contact avec la diapositive.

Affichez la vue à travers le microscope dans le logiciel d’imagerie. Ajustez bien le temps d’exposition par rapport à une norme de concentration élevée pour vous assurer que l’image ne sera pas saturée. Ensuite, ouvrez l’outil pour la numérisation de grandes images, et réglez le grossissement objectif à 10x.

Choisissez de fermer l’obturateur actif pendant le mouvement de la scène et d’attendre 20 millisecondes avant chaque capture. Réglez le chevauchement de couture à 20% et sélectionnez couture via le chemin optimal. Choisissez de créer une grande image à partir de l’analyse.

Réglez la caméra pour qu’elle se concentre manuellement au début de l’analyse et activez la mise au point automatique étape par étape tous les 20 champs. Ensuite, choisissez de définir les limites gauche, droite, haut et bas pour le champ d’analyse cible, et de définir la zone de balayage en déplaçant l’étape du microscope à chacune des limites souhaitées. Ensuite, ajustez la mise au point, le condenseur et l’éclairage de la zone pour obtenir une image claire et bien éclairée.

Nommez le fichier d’image à créer et démarrez l’analyse. Quand il se termine, ouvrez l’image et enregistrez-la à l’échelle 1/8. Ouvrez le logiciel d’analyse d’image.

Ensuite, ouvrez le menu Plugins, cliquez sur DSM Scan, définissez le nombre de colonnes et de lignes, réglez le pourcentage de resize à 25, définissez le diamètre de la tache, en pixels, à 190 à 200, réglez la plage de diamètre à 32, et définissez le diamètre d’incrément, en pixels, à huit. Réglez les limites de DSM basses et élevées à zéro et 62, la distance adjacente à 100, et le biais de soustraction à zéro. Exécutez l’algorithme DSM et enregistrez les données qui en résultent.

La technique d’analyse DSM a montré une bonne reproductibilité à travers des échantillons d’exosome PANC-1 dilués en série allant de 0,24 à 1,2 microgramme par microlitre. Une forte corrélation linéaire a été observée entre la réponse de dispersion des nanorods d’or et la concentration exosome de protéine. Une différence significative dans l’abondance des exosomes de sérum exprimant le biomarqueur cancer-associé EphA2 a été observée entre les patients présentant le cancer pancréatique et les patients en bonne santé.

À partir de l’ajout d’un agent bloquant, il est essentiel d’obtenir un tuyautage rapide et précis pour éviter l’évaporation des échantillons, l’introduction d’une contamination croisée et le grattage de la surface de la glissière. Après cette procédure, nous effectuons une analyse statistique pour étudier toute corrélation entre l’expression du biomarqueur exosomal d’intérêt et le stade différent de la maladie qui est à l’étude. Après avoir établi cette technologie, et nous sommes en mesure de trouver des biomarqueurs exosomaux pour les cancers du pancréas à un stade précoce.

À l’heure actuelle, nous étendons cette découverte à d’autres types de cancers et de maladies infectieuses. Habituellement, les échantillons manipulés dans ce test sont soit des échantillons de patients ou des échantillons d’exosome purifiés provenant de lignées de cellules cancéreuses, ce qui nécessite une formation spéciale en matière de sécurité.