Quantification de la résistance aux antibiotiques médiées par Plasmid dans une approche expérimentale d'évolution

Les plasmides sont des éléments extrachromosomiques qui sont omniprésents dans la plupart des espèces bactériennes et des habitats où ils sont des agents très importants du transfert latéral de gènes car ils peuvent migrer entre les cellules et entre les populations. L’un des exemples les plus frappants et les plus marquants d’un tel transfert est la diffusion de gènes de résistance aux antibiotiques qui sont codés sur les plasmides. Pour construire un modèle de plasmide qui code un gène de résistance aux antibiotiques, choisissez une colonne vertébrale plasmide et PCR amplifier l’épine dorsale en utilisant une polymése haute fidélité et des amorces qui se lient sur le modèle plasmide. Dans notre cas, nous avons utilisé une colonne vertébrale plasmide pBBR1. Ensuite, amplifiez le gène de résistance nptII, y compris le promoteur natif Tn5 à l’aide d’une polymése haute fidélité. Concevoir les amorces pour le gène de résistance avec environ 20 paires de base de complémentarité de séquence à l’épine dorsale plasmide. Après les PCR, fusionner la région homologique du gène de résistance purifié PCR produit à l’épine dorsale plasmide purifiée en utilisant l’assemblage isothermal à 50 degrés pendant 60 minutes. Transformez le produit fondu en E.Coli DH5-Alpha à l’aide de l’électroporation. Plaque 100 microlitre du mélange sur les supports sélectifs et incuber à 37 degrés pendant environ 24 heures. Le plasmide peut ensuite être extrait, validé et transformé en souche de type sauvage MG1655. Ceci donne la souche MG1655 pCON.During exposition aux antibiotiques, les bactéries ont besoin du plasmide pour survivre. Ainsi, le plasmide fait l’objet d’une sélection positive. Dans des conditions non sélectives, donc sans antibiotiques, le plasmide est jetable à la cellule. Le but de notre étude était de suivre les plasmides dans de telles conditions non sélectives au fil du temps. À cette fin, nous avons équipé les petits plasmides d’un gène de résistance aux antibiotiques et l’avons introduit à Escherichia coli. Nous avons mené une expérience évolutive et surveillé la fréquence des plasmides par le placage de réplique. Le plasmide porteur de la souche mg1655 pCON est maintenant introduit dans une expérience d’évolution. Tout d’abord, plaque mg1655 pCON sur les plaques d’agar LB complétées par des antibiotiques et incuber toute la nuit à 37 degrés. De cette plaque choisir au hasard les 8 colonies d’ancêtre et d’incuber toute la nuit à 37 degrés avec des secousses constantes. Le lendemain, les populations sont transférées à l’expérience menée dans 96 plaques de puits profonds. Il est très important de distribuer aléatoirement les répliques sur toute la plaque. Par exemple, dans une approche damier. Dans notre expérience, les cultures sont diluées et transférées avec des taux de dilution différents et en deux températures. Lors de chaque événement de transfert, le traitement de dilution est appliqué et le transfert en série est répété sur un total de 98 transferts. Le long de l’expérience d’évolution, la fréquence des plasmides dans la population est estimée à partir de la proportion de cellules transporteuses de plasmides. Le placage réplique a été popularisé par Esther et Joshua Lederberg dans les années 1950 où ils l’ont utilisé afin d’étudier la résistance aux médicaments chez les bactéries. La méthode leur permettra de mettre à l’échelle leur balayage pour les phénotypes et à la fin de l’étude a révélé que la résistance à la pénicilline peut survenir chez les bactéries en raison de mutations spontanées dans le génome. Pour déterminer la fréquence des plasmides dans la population au cours de l’expérience, les cultures stationnaires sont diluées en série et plaquées sur des plaques d’agar LB non sélectives. Ajuster la dilution en fonction d’un rendement de 250 à 500 colonies par plaque. Les populations plaquées sont incubées pour une croissance nocturne à 37 degrés pendant moins de 24 heures. Les colonies sont mieux répliquées lorsqu’elles sont encore petites. Après la nuit, comptez toutes les colonies à l’aide d’un compteur de colonie automatisé du choix du lecteur. Cela donne la taille totale de la population de bactéries dans les cultures. Notez que les colonies au bord de la plaque doivent être laissées de côté. Pour reproduire les plaques, vous avez besoin de plaques d’agar sélectives complétées par des antibiotiques, un bloc rond, un anneau métallique qui s’adapte au bloc, et tissu de velours stérile. Le tissu doit être 100% coton car cela peut être stérilisé par autoclavation. Placez le tissu sur le bloc et fixez-le avec l’anneau en métal.Placez soigneusement la plaque avec les colonies comptées sur la surface fixe en tissu de velours. Appuyez sur la plaque dans les mouvements circulaires de sorte que toute la surface de la plaque touche le tissu. Il est très important que toutes les colonies touchent le velours. Retirer la plaque LB et placer la plaque sélective sur le velours. Répétez le tapage soigneur. Il est encore une fois important que la plaque touche complètement le velours. Ensuite, retirer la plaque sélective. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, la LB et la plaque antibiotique sont nécessaires pour l’évaluation. Placez les plaques les unes au-dessus des autres et comparez la croissance. Vous pouvez facilement repérer les espaces exempts de colonies. Ce sont les colonies qui ne sont pas résistantes aux antibiotiques. Ainsi, ces colonies ont perdu le plasmide. En fin de compte, marquer le nombre de colonies manquantes sur la plaque antibiotique. Ce nombre vous donne la perte de plasmide. Répétez le placage réplique de toutes les populations au cours de l’expérience d’évolution chaque semaine. La perte de plasmide peut être provoquée par la malformation multiplasmide. Lorsque vous travaillez sur une construction plasmide dire pour l’expression d’un gène donné dans votre souche hôte préféré le comportement natif d’un plasmide in vivo en ce qui concerne la confirmation d’un état peut prendre est généralement quelque chose qui est négligé. Mais dans un contexte évolutif, une telle confirmation des changements pourrait être d’une très grande importance. L’analyse des confirmations plasmides peut être une entreprise très délicate. En particulier, les multimères plasmides sont difficiles à analyser parce qu’ils ne peuvent pas être identifiés correctement par PCR ou par séquençage. De l’autre côté, les multimères plasmides sont difficiles à analyser par électrophorèse gel en raison de leur taille potentiellement grande et leur mobilité électrophoretic lente. Notre protocole offre une méthode simple et simple pour le criblage et l’identification des multimères plasmides dans je dirais n’importe quelle préparation plasmide donnée. Pour les molécules plasmides visuelles extraire le plasmide de 5 mL stationnaire de la culture cellulaire pendant la nuit en utilisant la lyse alcaline. L’extraction plasmide de plasmides à faible copie entraîne souvent une contamination par l’ADN chromosomique de l’hôte qui doit être digéré avant la visualisation. Pour éliminer la contamination chromosomique de l’ADN traiter l’ADN plasmide extrait avec Plasmid-Safe