Génération, maintenance et caractérisation d’organoïdes intestinaux et coliques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Le protocole suivant décrit une génération d’organoïdes intestinaux et coliques humains à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette technique permettra à l’utilisateur d’interroger les voies impliquées dans la structuration intestinale. Cette technique permet à l’utilisateur de générer des organoïdes isogéniques spécifiques à une région. Ce protocole pourrait donner un aperçu des facteurs qui régulent l’établissement et le maintien de la structuration intestinale.

[Narrateur] Commencez par placer une matrice extracellulaire ou une plaque à 24 puits recouverte d’ECM à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pendant 30 minutes pour lui permettre d’atteindre la température ambiante. Placez la solution complète de détachement de cellules moyennes mTeSR1 et le DMEM avancé dans un bain de billes à 37 degrés Celsius et laissez-les se réchauffer pendant 30 minutes. Préparez le milieu de placage dans un tube conique de 50 millilitres en ajoutant 13 millilitres de mTeSR1 et 13 microlitres de 10 millimoles Y-27632 Rho-associated protein kinase ou inhibiteur de ROCK. Pour prélever des cellules de la plaque à six puits, aspirez le milieu de trois à quatre puits et lavez-le une fois avec deux millilitres de DMEM avancé par puits. Aspirez le DMEM avancé et distribuez un millilitre de la solution de dissociation cellulaire dans chaque puits. Incuber la plaque pendant cinq à sept minutes à l’intérieur d’un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius. Dissociez tout amas de cellules en pipetant de haut en bas quatre à cinq fois à l’aide d’une pipette de cinq millilitres pour préparer la suspension cellulaire. Ajoutez deux millilitres de DMEM avancé dans chaque puits. Pipetez doucement de haut en bas quatre à cinq fois et transférez dans un tube conique de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 300 G pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez le fluide du tube sans aspirer la pastille de cellule. Et ajoutez six millilitres du milieu préparé de mTeSR1 plus inhibiteur de ROCK. Remettez doucement les cellules en suspension en les pipetant de haut en bas trois à quatre fois. Transférez ensuite la suspension dans le reste du milieu inhibiteur de mTeSR1 et ROCK à l’intérieur du tube de 50 millilitres. Remettez vigoureusement en suspension quatre à cinq fois et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Aspirez l’ECM de la plaque à 24 puits juste avant de plaquer les cellules. Remettez les cellules en suspension en pipetant deux à trois fois de haut en bas, et distribuez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits. Basculez doucement la plaque trois fois dans le sens des aiguilles d’une montre, trois fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, trois fois vers l’avant et vers l’arrière et trois fois d’un côté à l’autre pour disperser uniformément les cellules. Transférez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, et incubez pendant 24 heures. Après 24 heures, aspirez le milieu épuisé. Ajouter 0,5 millilitre par puits de mTeSR1 et incuber à nouveau pendant 24 heures dans les mêmes conditions. Préparez le milieu complet d’Activin le premier jour en diluant la solution mère d’Activin A de 100 microgrammes par millilitre et de 100 microgrammes de BMP4 dans le milieu d’Activin du premier jour dans un tube conique. Réchauffez le milieu dans un bain de billes à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu mTeSR1 de la plaque à 24 puits et ajoutez 0,5 millilitre de milieu Activin par puits. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, et incubez pendant 24 heures. Vérifiez les cellules après 24 heures. Préparez le milieu complet Activin le deuxième jour en diluant les 100 microgrammes par millilitre d’Activin A dans le milieu Activin du deuxième jour dans un tube conique, et placez le tube dans un bain de billes à 37 degrés Celsius. Retirez la plaque de différenciation à 24 puits de l’incubateur de dioxyde de carbone et retirez le milieu usé. Distribuez 0,5 millilitre de milieu Activin préchauffé le deuxième jour par puits et remettez la plaque à l’intérieur de l’incubateur de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Préparez le milieu complet Activin le troisième jour en diluant les 100 microgrammes par millilitre d’Activin A dans le milieu Activin du troisième jour dans un tube conique, et placez le tube dans un bain de billes à 37 degrés Celsius. Retirez le milieu épuisé et distribuez 0,5 millilitre de milieu Activin le troisième jour par puits. Pour commencer par la différenciation de l’endoderme définitif en sphéroïdes de l’intestin moyen, ajoutez 25 millilitres de milieu d’induction de l’intestin moyen postérieur avec FGF4 dans un tube conique de 50 millilitres et placez-le dans un bain de billes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour préparer le milieu d’induction complet de l’intestin moyen, ajoutez 7,5 microlitres de CHIR99021 une fois que le milieu est chaud. Retirez le milieu épuisé, distribuez 0,5 millilitre de milieu d’induction de l’intestin moyen postérieur par puits et incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après la condensation des cellules à l’intérieur de la monocouche le lendemain, remplacez le milieu épuisé par un milieu d’induction frais de l’intestin postérieur et replacez la plaque pour l’incubation pendant 24 heures. Pour éviter de jeter les sphéroïdes flottants lors du changement de milieu, transférez l’ancien milieu dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 300 G pendant une minute. Remettez les sphéroïdes en suspension dans 12,5 millilitres de milieu d’induction frais de l’intestin moyen, ajoutez 0,5 millilitres par puits dans la même plaque à 24 puits et incubez pendant 24 heures dans l’incubateur. Le quatrième jour de l’induction de l’intestin postérieur, récoltez les sphéroïdes flottants dans les puits de la plaque en recueillant le milieu dans un tube de 15 millilitres, suivi d’une centrifugation à 300 G pendant une minute. L’efficacité de l’induction définitive de l’endoderme a été évaluée en effectuant une coloration par immunofluorescence pour FOXA2 et SOX17. L’expression de l’ARNm du facteur HOX antérieur HOXD3 s’est avérée être la plus élevée dans les organoïdes intestinaux humains traités par Noggin ou HIO, moins dans les HIO traités par le facteur de croissance épithéliale ou EGF, et la plus faible dans les organoïdes du côlon humain ou HCO traités par BMP. À l’inverse, les expressions de l’ARNm HOXA13 et HOXD13 se sont avérées faibles dans les HIO et élevées dans les HCO. Une coloration par immunofluorescence a été réalisée pour SATB2, CDX2 et CDH1 afin de déterminer si l’épithélium HCO était correctement structuré.