Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

Ce protocole décrit une série de techniques au sein d’un flux de travail continu qui peuvent être utilisées pour évaluer les effets in vivo des régulateurs candidats des métastases du mélanome, mais aussi des métastases d’autres tumeurs malignes solides. Le principal avantage de notre flux de travail systématique est une reproductibilité accrue des données grâce à des modèles et des techniques in vivo robustes et standardisés. Ce pipeline offre une voie pour la découverte de cibles et le développement de thérapies en testant des candidats déduits de données Omics ou de tests in vitro dans un contexte in vivo.

La courbe d’apprentissage associée aux techniques présentées dans ce protocole est raccourcie en utilisant le matériel fourni et en suivant la description détaillée lors de la pratique des étapes. Orlando Aristizabal, chercheur scientifique au Préclinical Imaging Core et Ran Moubarak, instructeur dans mon laboratoire, aideront à démontrer la procédure. Pour les injections intradermiques, anesthésiez et rasez une souris de huit à 10 semaines à l’intérieur d’une armoire de biosécurité tout en maintenant des conditions aseptiques.

Ensuite, saisissez et rétractez la peau vers l’arrière contre la trajectoire de l’aiguille et, à l’aide d’une aiguille de seringue à insuline de six millimètres de long et de calibre 31, perforez doucement la peau à un angle aigu avec le biseau tourné vers le haut. Injecter 30 microlitres de la suspension de la cellule tumorale lentement, jusqu’à ce qu’une roue en forme de dôme soit observée. Surveillez la progression de la croissance tumorale, la perte de poids et l’état de santé général.

Au cours de ces séances de surveillance, prenez des mesures avec des étriers et utilisez les dimensions de longueur et de largeur de la tumeur pour calculer le volume. Pour les injections intracardiaques, transférer une souris anesthésiée sur la plate-forme chauffée de l’appareil à ultrasons. Ensuite, à l’aide de ruban hypoallergénique, fixez la souris au cône du nez.

Rasez le thorax avec une lame de rasoir droite ou une lame de scalpel, inclinée à un angle de 30 degrés et nettoyez la peau autour de la zone de procédure avec 10% d’iode de povidone. Ensuite, positionnez la sonde à ultrasons au milieu du thorax sur le côté gauche de la souris pour capturer une fenêtre horizontale orientée pour obtenir une vue en coupe transversale du ventricule gauche. Avec le long axe de la sonde tourné vers le haut, fixez la sonde à un angle de 50 degrés et la plate-forme chauffée à un angle de 20 degrés, puis verrouillez la sonde et le cadre de support en position.

Lorsque vous travaillez à l’intérieur de l’armoire de sécurité, dessinez la suspension de la cellule dans une seringue tuberculine d’un millilitre avec une aiguille d’un pouce de calibre 30. Retirez toutes les bulles d’air présentes dans la seringue. Verrouillez la seringue dans l’injecteur stéréotaxique.

Et puis, sous guidage échographique, avancez l’aiguille à travers la paroi thoracique dans le ventricule gauche du cœur et injectez lentement 100 à 250 microlitres de la suspension de cellules tumorales. Pour la chirurgie de survie par étapes, placez la souris anesthésiée sur le coussin chauffant et nettoyez la peau autour de la zone de procédure avec une solution d’iode à 10% de povidone. Après avoir enfilé un équipement de protection individuelle stérile et des gants, déposez un drap stérile sur le corps de l’animal.

Ensuite, à l’aide de ciseaux à iris ou d’un scalpel, inciser la peau, en maintenant une marge de résection de cinq à sept millimètres du bord de la tumeur. En cas de tumeurs intradermiques, réséquez la tumeur avec la peau circonférentielle. Pour les tumeurs sous-cutanées, disséquez et enlevez la tumeur sous la peau.

Après la résection de la tumeur, fermez la plaie avec un dispositif d’agrafage de neuf millimètres. Pour l’imagerie in vivo, administrer le substrat de d-luciférine à la souris par injection intrapéritonéale avec une seringue à insuline d’un millilitre et une aiguille de calibre 28, puis anesthésier la souris et la placer dans un cône de nez à l’intérieur du scanner d’imagerie de bioluminescence. Démarrez l’instrument en appuyant sur initialiser et réglez le temps d’exposition sur auto.

Pour capturer une image vierge pour la soustraction d’arrière-plan, cliquez sur Acquérir et enregistrez l’image une fois la séquence d’acquisition terminée. Pour l’analyse des données et le même logiciel d’imagerie in vivo, accédez au dossier où les images sont enregistrées et ouvrez les images de toutes les souris d’une expérience. Réglez les unités sur l’éclat et assurez-vous que la case à cocher indiquant l’individu n’est pas cochée, car cela empêchera la normalisation du signal entre les groupes.

Ensuite, à l’aide de la région d’intérêt ou de l’outil de dessin du retour sur investissement, dessinez des rois circulaires pour la région du cerveau et des rois rectangulaires pour le corps, excluez les oreilles et le nez dans le roi du cerveau car ils ont tendance à émettre une luminance non spécifique. Pour minimiser les biais, dessinez des retours sur investissement sur les photographies des souris sans le signal luminescent superposé, puis sélectionnez les retours sur investissement de mesure pour quantifier le signal et exporter les données vers une feuille de calcul. Analyser les différences entre les groupes en traçant le flux luminescent total dans les régions du corps d’intérêt.

Après une coloration NuMA à l’aide d’un logiciel, dessinez un retour sur investissement pour inclure toutes les cellules colorées NuMA dans le tissu organique, à l’exception des autres parenchymes d’organes et des espaces vides. Ajustez les paramètres pour catégoriser les cellules NuMA positives et NuMA négatives tout en utilisant des contrôles positifs et négatifs appropriés pour chaque organe. Utilisez un algorithme logiciel établi pour quantifier le nombre total de cellules NuMA positives pour chaque échantillon.

La bioluminescence, le champ lumineux, la fluorescence ex vivo et les images de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine illustrent l’approche à plusieurs volets pour l’analyse des effets des gènes candidats sur les métastases du mélanome. Le silençage de la fucosyltransférase a altéré la dissémination métastatique des cellules de mélanome. Les sections pulmonaires colorées NuMA des cellules de mélanome infectées par le virus Linda témoin et par un suppresseur de métastase exprimant le virus Linda sont présentées ici.

Les cellules métastatiques du mélanome sont marquées en vert et la zone de l’organe est délimitée par une ligne verte hachurée. Maintenir une tension adéquate dans la peau lors des injections intradermiques, éviter l’embolie aérienne lors de la préparation des seringues et obtenir des marges de résection adéquates qui ne devraient pas interférer avec la locomotion de l’animal ou le prédisposer aux complications de la plaie, aident à améliorer le taux de réussite et la reproductibilité. L’utilisation ultérieure de l’imagerie multiplex pour examiner la filtration immunitaire, le séquençage de l’ARN unicellulaire pour l’analyse de l’expression génique et la transcriptomique spatiale pourraient tous fournir des avenues complémentaires pour examiner l’hétérogénéité intratumorale.

La combinaison de techniques décrites dans ce protocole nous a aidés à identifier de nouveaux régulateurs dans les métastases cérébrales du mélanome, tels que le rôle du mélanome sécrété par la bêta-amyloïde dans la suppression de la neuroinflammation et la promotion des métastases cérébrales.