Assay Métastases expérimentales

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester les capacités métastatiques de cellules cancéreuses humaines par des injections intraveineuses via la veine caudale. Chez des souris immunodéficientes, les cellules sont préparées pour injection. Ces cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéficientes, ce qui entraîne la formation de métastases pulmonaires après un à deux mois.

Les souris sont disséquées et les métastases pulmonaires sont quantifiées et mises en culture. Les résultats de ce type de test indiquent l'importance des métastases d'un type particulier de cellule cancéreuse. Bonjour, je suis Sonali Mohanty du laboratoire du Dr LE, du Département de génétique biomédicale de l'Université de Rochester.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure pour réaliser un test de métastase expérimentale. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la métastase cancéreuse. Commençons donc.

Commencez avec des cellules cultivées à environ 70 % de confluence. Aspirez le milieu de la plaque et rincez délicatement une fois avec un X PBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de trypsine 0,05 % en inversant. Secouez doucement la plaque pour faciliter le détachement des cellules.

Observer les cellules au microscope pendant qu'elles se détachent. Ajouter un volume suffisant de milieu contenant du FBS pour inhiber l'activité de la trypsine. Ensuite, transférer dans un tube de 50 millilitres.

Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Une fois la concentration déterminée, centrifuger à environ 200 ×g pendant trois minutes sans perturber le culot cellulaire. Retirer soigneusement le milieu et resuspendre dans un volume approprié de solution tampon équilibrée de Hank ou HBSS afin d'obtenir une concentration finale d'environ cinq fois 10⁶ cellules par millilitre.

Ensuite, filtrez à l’aide d’un tamis cellulaire Falcon de 70 micromètres. Pour éliminer les agrégats cellulaires de grande taille, placez la pointe de la pipette directement sur le filtre, positionné au-dessus d’un tube de culture de cinq millilitres. Éjectez rapidement la suspension à travers le filtre dans le tube.

Compter à nouveau les cellules à l'aide de bleu de trypan pour déterminer la viabilité. La viabilité doit être supérieure à 90 % avant l'injection. Ensuite, diluer jusqu'à une concentration finale de 2,5 × 10⁶ cellules par millilitre.

Gardez sur glace. Saisissez délicatement la queue d'une souris immunodéficiente et faites-la entrer dans le dispositif de contention, le dos contre la fente, la queue sortant par l'ouverture arrière. Faites lentement glisser l'anneau vers l'intérieur le long de la fente.

Une fois que l'anneau a saisi la bouche de la souris, fixez-le en place. La souris ne doit pas pouvoir bouger librement, mais doit présenter un rythme respiratoire normal. Repérez les veines principales de la queue.

Quatre vaisseaux sanguins majeurs sont présents dans la queue d'une souris. Les artères se trouvent sur les côtés dorsal et ventral de la queue. Les veines sont situées sur les côtés latéraux.

Aspirez au moins 200 microlitres des cellules préparées dans une seringue d'un millilitre. Fixez une aiguille de 30 gauge de demi-pouce et expulsez toutes les bulles d'air. Le volume final dans la seringue doit être de 200 microlitres.

Préparez-vous à injecter à l'extrémité distale de la queue. Ainsi, si la première tentative échoue, une région plus proximale de la queue pourra être utilisée pour une deuxième tentative. Après avoir nettoyé le site d'injection avec de l'éthanol à 70 %, tirez la queue en la maintenant droite.

Tenez la pointe avec le pouce et soutenez l'extrémité destinée à l'injection avec l'index. Insérez l'aiguille dans la veine et injectez les cellules. Veillez à ce que l'aiguille et la seringue restent parallèles à la veine pendant l'injection.

Dans le cas contraire, l'aiguille transpercera la paroi du vaisseau et les cellules seront injectées dans les tissus adjacents de la queue. Retirez l'aiguille si la procédure s'est déroulée avec succès. Le sang doit perfuser à partir du site d'injection.

Appuyez un coton propre pour faciliter le passage du fil dentaire et palpez la queue vers le haut afin de pousser tout échantillon résiduel dans la circulation. Libérez la souris du dispositif de contention et remettez-la dans la cage. Notez le nombre de tentatives d'injection et le nombre de cellules injectées dans un cahier de laboratoire.

Déterminer la viabilité des cellules après l'injection. Comme précédemment, cette étape permet de s'assurer que les cellules restent vivantes tout au long du processus d'injection. À la fin d'une expérience d'injection, la viabilité des cellules diminuera, mais devrait rester supérieure à 80 %. En tant qu'étape facultative, centrifuger les cellules restantes et rincer les culots une fois avec du PBS.

Ensuite, congeler les culots à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures telles que le western blot. Pour confirmer l'expression génique après les inhibitions par ARN interférent, dissez les souris au bout d'un à deux mois afin de déterminer les localisations des métastases. Commencez par placer la souris euthanasiée sur une station de dissection.

Pulvérisez généreusement la souris avec de l'éthanol. Incisez la cage thoracique pour exposer les poumons et le cœur. Ensuite, excisez-les soigneusement et placez-les dans du PBS.

Le poumon est le site principal de métastase car il contient le premier lit capillaire que les cellules rencontrent. Après leur entrée dans la circulation, retirez le cœur et rincez les poumons dans du PBS, puis observez chaque lobe du poumon au microscope stéréoscopique. Comptez le nombre de métastases détectables sur les deux côtés du poumon, puis additionnez les nombres de métastases pulmonaires sur les quatre lobes ensemble pour déterminer le nombre total de métastases pulmonaires.

Ensuite, isolez individuellement les métastases pulmonaires par excision à l’aide de ciseaux. Transférez chaque métastase vers une passoire cellulaire de 70 micromètres et hachez-la en utilisant l’extrémité d’un capuchon stérile d’aiguille. Rincez la passoire cellulaire avec plusieurs millilitres de milieu et récupérez les cellules ayant traversé le filtre.

Dans une boîte de culture, chaque boîte contient les cellules provenant d'une métastase. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre jours sans perturbation. Initialement, les cellules cancéreuses et les cellules fibroblastes pousseront sur les boîtes, mais progressivement, les cellules fibroblastes disparaîtront et seront remplacées par les cellules cancéreuses.

Si les cellules cancéreuses portent des gènes de résistance aux médicaments, sélectionnez les cellules à l’aide des antibiotiques correspondants. Après trois jours, éliminez tout résidu sanguin ou tissulaire, ainsi que les débris présents sur la boîte à l’aide de PBS, puis ajoutez un milieu frais. Évaluez la pureté des cellules obtenues par immunomarquage à l’aide d’anticorps dirigés contre des protéines spécifiques humaines ; un anticorps anti-humain est utilisé même en l’absence de sélection par médicament. Plus de 99 % des cellules doivent être d’origine humaine.

Les cellules nouvellement obtenues peuvent désormais être réinjectées dans des souris immunodéficientes afin de tester leurs capacités métastatiques à la fin de ce test. Une lignée cellulaire cancéreuse fortement métastatique donne généralement lieu à de nombreuses métastases pulmonaires, tandis qu'une lignée cellulaire cancéreuse faiblement métastatique en produit très peu. Ces images montrent des métastases pulmonaires deux mois après l'injection de la lignée cellulaire de mélanome humain.

Un 3 7 5 sm. Les cellules dérivées à l’aide de cette méthode donnent généralement lieu à davantage de métastases que la lignée parentale lorsqu’elles sont testées. En utilisant à nouveau cet essai, nous venons de vous montrer la procédure à suivre pour réaliser un essai de métastase expérimentale.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est très important de vous assurer que les cellules sont injectées dans la veine de la queue, mais pas dans les tissus environnants ni dans la queue elle-même. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.