Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes
6 octobre 2022
Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.
Cette méthode offre un moyen d’amplifier le signal des événements de liaison sous une forme détectable visuellement pour une utilisation à faible ressource ou pouvant être quantifiée à l’aide d’une instrumentation basée sur l’absorbance. Il s’agit d’un protocole relativement rapide et unique pour déterminer la présence de la cible de l’aptamère dans un échantillon d’intérêt. Les résultats peuvent être comparés à une courbe d’étalonnage standard si une quantification est souhaitée.
Les individus doivent être très précis lors du transfert et du mélange des solutions, car un mélange insuffisant entraînera des résultats négatifs. Assurez-vous également que les réactifs et les solutions sont conservés au frais jusqu’à leur utilisation afin de minimiser le signal de fond. Commencez par activer les produits de clivage du ribozyme en ajoutant cinq unités de polynucléotide kinase T4 dans un tube de PCR.
Ensuite, ajoutez un microlitre de tampon ribozyme 5X pré-préparé à chaque tube d’échantillon. Pour démontrer visuellement la spécificité, ajoutez 1,5 microlitre de théophylline millimolaire ou deux millimolaires de caféine à chaque tube d’essai comme échantillons d’essai et mélangez soigneusement chaque échantillon en pipetant cinq à 10 fois. Ensuite, ajoutez deux microlitres de 600 nanomolaires d’ARN contenant un domaine aptamique spécifique à la cible à chaque tube d’échantillon, puis un pipetage pour mélanger rapidement les composants.
Maintenant, placez le tube sur un bloc froid pour minimiser le signal de fond. Après avoir préparé tous les tubes de réaction, incuber chaque échantillon à température ambiante pendant exactement trois minutes. À la fin de l’incubation, remettre immédiatement les tubes d’échantillon dans la glace.
Ajouter 3,5 microlitres de mélange enzymatique de polymérase nicase à chaque tube d’échantillon et bien mélanger. Ensuite, ajouter 31,5 microlitres de mélange réactionnel EXPAR contenant des nucléotides matrices et un tampon réactionnel à chaque tube d’échantillon et mélanger par pipetage. Une fois tous les échantillons préparés, incuber l’échantillon préparé à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes à l’aide d’une minuterie.
Remettre immédiatement les tubes d’échantillon dans la glace après l’incubation. Ajouter deux microlitres de solution d’hémine à chaque tube d’échantillon pour le développement de la couleur et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 58 microlitres de la solution TMB disponible dans le commerce à chaque tube d’échantillon, mélangez bien et incuber pour le développement de la couleur.
Lire les échantillons qualitativement à l’œil nu ou quantifier les résultats à l’aide d’un lecteur de plaque absorbante, comme décrit dans le manuscrit. La construction optimisée pourrait reconnaître aussi peu que 500 nanomolaires théophylline en 30 minutes. Les préparations d’échantillons exposées à la cible produisent une couleur bleue, tandis que les échantillons ne contenant aucune cible restent incolores.
Une courbe standard a été préparée à partir du signal mesuré à A450 après 30 minutes de développement des couleurs. Il est important de garder les échantillons sur la glace lorsque vous n’effectuez pas d’incubations, car même l’ARN optimisé présentera toujours un faible niveau d’activité de fond.
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Aperçu
Ce protocole décrit un test d'amplification exponentielle rapide, en trois étapes, basé sur un aptamère, permettant la détection de cibles telles que la théophylline. Il couvre la préparation de l'échantillon, l'amplification du signal et le développement de la couleur.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Chimie analytique
- Biotechnologie
Contexte général
- Les aptamères sont de courtes molécules d'ARN ou d'ADN simples brins capables de se lier à des cibles spécifiques.
- L'amplification du signal est cruciale pour la détection de cibles peu abondantes.
- Les méthodes de détection visuelle peuvent être avantageuses dans les contextes à ressources limitées.
- Une manipulation précise des réactifs est essentielle pour obtenir des résultats exacts.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rapide de détection de la théophylline par rapport à la caféine.
- Proposer un protocole en un seul récipient pour l'amplification du signal.
- Permettre la quantification des résultats à l'aide d'une courbe d'étalonnage.
Méthodes utilisées
- Activation des produits de clivage du ribozyme à l'aide de la polynucléotide kinase T4.
- Détection visuelle des événements de liaison.
- Quantification à l'aide d'un instrument basé sur l'absorbance.
- Mélange soigneux et refroidissement des réactifs pour minimiser le signal de fond.
Résultats principaux
- La méthode permet la détection de la théophylline dans des échantillons.
- Les résultats peuvent être interprétés visuellement ou quantifiés.
- La précision dans la manipulation des solutions est essentielle pour obtenir des résultats concluants.
- Les signaux de fond peuvent être minimisés grâce à une gestion adéquate des réactifs.
Conclusions
- Le test basé sur des aptamères est une méthode rapide et efficace pour la détection de cibles.
- Il peut être adapté à diverses applications dans des environnements à ressources limitées.
- De futures études pourraient explorer d'autres cibles et l'optimisation du protocole.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les systèmes de détection basés sur des aptamères avec amplification exponentielle isotherme offrent des résultats rapides, sensibles et interprétables visuellement pour la validation de cibles dans les flux de travail de découverte précoce. Ce protocole d'amplification en trois étapes basé sur des structures en G-quadruplex permet des lectures qualitatives et quantitatives, soutenant ainsi une prise de décision robuste lors du développement de tests et aux points critiques de criblage. Cette approche renforce la confiance prédictive concernant l'interaction avec la cible et sa spécificité, influant directement sur le tri du portefeuille et la préparation aux tests en aval.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation directe des événements de reconnaissance moléculaire en utilisant la spécificité des aptamères.
- Permet la validation fonctionnelle de la liaison à la cible grâce à des signaux détectables visuellement.
- Facilite l'évaluation rapide de l'interaction avec la cible pour une détection précoce des risques mécanistiques.
- Améliore la confiance dans la sélectivité de la cible en distinguant des analytes étroitement apparentés.
Développement de criblages et de tests
- Propose un protocole standardisé en un seul récipient pour une mise en place reproductible du test.
- Fournit des résultats quantitatifs par mesure d'absorbance pour une évaluation fiable des composés.
- Permet un criblage rapide des échantillons avec des exigences minimales en matière d'instrumentation.
- Prend en charge la quantification basée sur une courbe d'étalonnage pour la standardisation du test.
Recherche translationnelle et préclinique
- Offre un potentiel d'adaptation à des biomarqueurs pertinents pour les maladies, lorsque cela est soutenu par la conception d'aptamères.
- Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique grâce à des formats de détection évolutifs.
- Réduit le risque de faux positifs en minimisant le signal de fond grâce à des protocoles optimisés.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le système aptamère-EXPAR s'inscrit dans la continuité entre la découverte précoce et l'identification de composés d'intérêt, offrant un pont entre la reconnaissance moléculaire et le développement d'essais quantitatifs.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies en confirmant la présence et la spécificité de la cible.
- Écrans de sélection : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles, adaptés aux environnements à haut débit ou aux ressources limitées.
- Analytique : Permet la mesure basée sur l'absorbance et la génération de courbes standards pour l'analyse comparative.
- Recherche translationnelle : Peut être adapté à la détection de biomarqueurs si la spécificité de l'aptamère est établie.
- Réutilisation en entreprise : La modularité du protocole permet son adaptation à de nouvelles cibles en remplaçant les domaines d'aptamères.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Simplifie les flux de travail grâce à un protocole rapide, standardisé et évolutif.
- Valeur stratégique : Permet des décisions accélérées d'aller/arrêt et un développement d'essais efficient en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en fournissant des données de détection robustes et quantitatives.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception d'aptamères et en manipulation des acides nucléiques.
- Exige un accès à des équipements de biologie moléculaire de base et à des lecteurs de plaques à absorption pour la quantification.
- Implique une manipulation précise des réactifs et une maîtrise rigoureuse de la température afin de minimiser le signal de fond.
- Le protocole peut être adapté à différentes cibles en modifiant le domaine aptamérique.
- Une optimisation minutieuse est nécessaire pour garantir la spécificité et réduire au minimum les faux positifs.
