Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés
16 août 2024
Ici, nous présentons la préparation étape par étape de l’amplification isotherme prémélangée et lyophilisée basée sur la recombinase et des réactions basées sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), qui peuvent être utilisées pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques d’agents pathogènes de maladies infectieuses ou d’autres marqueurs génétiques d’intérêt.
Nous développons des tests sur le lieu d’intervention pour détecter ces matériaux de maladies infectieuses. Ce test utilise l’amplification isotherme des acides nucléiques et la détection basée sur CRISPR. Avec une précision osmotique élevée similaire à la PCR, ils peuvent détecter de petites différences de séquence, y compris le polymorphisme nucléotidique unique, et peuvent être multiples.
CRISPR, les réactions osmotiques contiennent plusieurs composants et étapes et sont difficiles à réaliser sur le lieu de soins. Comme les osmotiques sont très sensibles, il existe un risque de contamination par transfert qui peut conduire à de faux résultats. Heureusement, ce problème peut être atténué si nous simplifions les procédures des réactions.
Nous proposons une méthode facile à utiliser pour détecter nos pathogènes et marqueurs génétiques à l’aide de la recombinase, de l’amplification isotherme et des réactifs basés sur CRISPR. Ces réactifs sont simples à stocker et à utiliser. Nous proposons également des conseils pour résoudre les problèmes courants lors de l’utilisation de ces méthodes et réactifs, ce qui facilite leur utilisation par les gens.
Le protocole utilise ici des réactifs CRISPR, qui facilitent le transport et le stockage. Les réactifs lyophilisés peuvent facilement être réhydratés aux points d’utilisation et conservent des efficacités d’amplification et de détection élevées. Nous espérons appliquer les technologies de diagnostic CRISPR pour détecter les maladies infectieuses endémiques et émergentes.
Si ce test peut être effectué régulièrement et correctement sur le lieu de soins, cela pourrait éclairer les options de traitement antiviral et antibiotique, potentiellement sauver des vies, réduire la surutilisation de médicaments et le développement de la résistance.
Aperçu
Cet article présente une méthode de développement de tests de diagnostic au point d’intervention qui utilisent l’amplification isotherme des acides nucléiques et la détection fondée sur CRISPR pour identifier le matériel génétique de maladies infectieuses. L’approche vise à améliorer la sensibilité et la précision tout en répondant à des défis tels que les risques de contamination.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Diagnostic des maladies infectieuses
- Techniques d'amplification des acides nucléiques
- Technologie CRISPR
Contexte
- Les tests diagnostiques réalisés au chevet du patient sont essentiels pour un diagnostic rapide des maladies infectieuses.
- L'amplification isotherme permet une détection efficace des acides nucléiques.
- La technologie CRISPR offre une grande sensibilité pour l'identification de matériel génétique.
- Les risques de contamination peuvent entraîner des résultats faux dans les tests sensibles.
Objectif de l'étude
- Développer une procédure simplifiée pour les réactions basées sur CRISPR.
- Améliorer la précision de la détection des petites variations génétiques.
- Réduire les risques de contamination dans les environnements de diagnostic au point d’intervention.
Méthodes utilisées
- Préparation de réactifs prémélangés et lyophilisés pour l'amplification isotherme.
- Mise en œuvre de méthodes de détection basées sur CRISPR.
- Évaluation de la sensibilité et de la spécificité dans la détection de biomarqueurs d'acides nucléiques.
- Optimisation des conditions de réaction afin de réduire les risques de contamination.
Résultats principaux
- La méthode développée a démontré une sensibilité élevée pour la détection de marqueurs génétiques.
- Les risques de contamination ont été significativement réduits grâce à la simplification des procédures.
- Les résultats étaient comparables à ceux des méthodes traditionnelles de PCR.
- L'approche est adaptée aux applications de diagnostic au point d'intervention.
Conclusions
- La présente étude décrit une méthode viable pour la détection rapide des agents pathogènes de maladies infectieuses.
- Les tests basés sur CRISPR peuvent être efficacement simplifiés pour une utilisation pratique.
- Les travaux futurs pourraient se concentrer sur l'amélioration supplémentaire de la robustesse des tests.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Des réactifs diagnostiques prémixés et lyophilisés basés sur CRISPR permettent une détection rapide et précise de marqueurs génétiques de maladies infectieuses au point d’intervention, en répondant aux goulots d’étranglement opérationnels liés aux tests décentralisés. Cette approche réduit la complexité de la manipulation manuelle ainsi que le risque de contamination, facilitant un déploiement à grande échelle dans des environnements à ressources limitées ou sur le terrain. La méthode améliore la confiance prédictive pour une intervention précoce et oriente en temps réel la prise de décisions thérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une interrogation rapide des marqueurs génétiques de pathogènes pour la validation de cibles en recherche sur les maladies infectieuses.
- Facilite la détection biologique en réduisant les risques grâce à une détection hautement sensible des polymorphismes de nucléotides simples.
- Permet le tri des portefeuilles en distinguant les souches de pathogènes étroitement apparentées.
Développement de tests et criblage
- Fournit des systèmes de réactifs validés et prêts à l'emploi pour des flux de travail de développement de tests simplifiés.
- Améliore la reproductibilité et la standardisation des tests grâce à des formats prémélangés et lyophilisés.
- Permet un criblage évolutif d'échantillons cliniques ou environnementaux avec un équipement minimal.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stratégies translationnelles de biomarqueurs en permettant la détection de signatures d'acides nucléiques pertinentes pour la maladie.
- Assure la continuité entre la découverte et la validation préclinique en fournissant des diagnostics robustes et utilisables sur le terrain.
- Réduit les risques lors du développement de candidats-diagnostiques en démontrant la stabilité et l'efficacité des réactifs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dès la phase de découverte initiale jusqu'à la recherche translationnelle, en soutenant les flux de travail allant de l'identification de la cible à la validation préclinique de plateformes diagnostiques.
- Biologie de la découverte : Permet la détection fiable de cibles génétiques pour les tests d'hypothèses et les études mécanistiques.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs standardisés pour comparer les conditions des échantillons et les performances des tests.
- Analytique : Permet des détections sensibles basées sur la fluorescence pour une analyse de données robuste et un soutien décisionnel.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre les applications en laboratoire et sur le terrain, en soutenant le développement de diagnostics fondés sur des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme de réactifs réutilisables, adaptable à diverses cibles pathogènes et types d'échantillons.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté dans la détection des agents pathogènes.
- Valeur opérationnelle : Simplifie les flux de travail, améliore la reproductibilité et soutient une logistique indépendante de la chaîne du froid.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt pour les candidats diagnostiques et réduit les risques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs diagnostiques destinés aux maladies émergentes et endémiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en amplification des acides nucléiques et en conception de tests basés sur CRISPR.
- Requiert un accès à un équipement de lyophilisation et à des lecteurs de microplaques à fluorescence pour exécuter l'ensemble du protocole.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de préparation et de manipulation des réactifs.
- Adaptable à divers types d'échantillons, mais peut nécessiter une optimisation pour des pathogènes spécifiques.
- La stabilité et l'efficacité sont validées pendant au moins huit mois à -20 °C, permettant un déploiement prolongé.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
