Amélioration des modèles de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales de pigments rétiniens humains hautement polarisés
14 avril 2023
Ce protocole décrit un modèle d’accumulation de lipofuscine dans des cultures épithéliales de pigment rétinien humain (EPR) hautement différenciées et polarisées et un test de phagocytose du segment externe (SG) amélioré pour détecter la capacité totale de consommation/dégradation de la SG de l’EPR. Ces méthodes surmontent les limites des modèles précédents de lipofuscine et des tests classiques de phagocytose du segment externe par impulsions.
Alors que la lipofuscine s’accumule universellement dans l’EPR avec le vieillissement, discerner sa toxicité a été difficile. Ici, nous développons des protocoles qui nous permettent de développer une accumulation de type lipofuscine dans des cultures d’EPR hautement polarisées et matures pour aider à discerner les effets de la lipofuscine sur la physiologie de l’EPR. L’étude de la toxicité de la lipofuscine chez l’homme est confondue par le fait que la lipofuscine diminue à mesure que l’EPR meurt.
Les modèles animaux de toxicité de la lipofuscine ont eu des résultats très disparates. Nous avons soigneusement créé des modèles in vitro d’accumulation de matériaux de type lipofuscine pour faciliter l’étude de la toxicité de la lipofuscine. La clé du succès de nos modèles est de maintenir des cultures hautement différenciées tout en induisant la genèse de la lipofuscine via le même processus qui déclenche la lipofuscine in vivo, à savoir la phagocytose des segments externes des photorécepteurs.
Notre protocole in vitro est unique en ce sens que le matériel de type lipofuscine s’accumule dans des cultures d’EPR hautement différenciées pour imiter fidèlement l’EPR in vivo. Dans ces circonstances, nous avons constaté que les cultures d’EPR sont très résistantes à l’accumulation de lipofuscine et à l’effet toxique de la lipofuscine. De plus, dans le processus d’analyse des phénotypes induits par l’accumulation de type lipofuscine dans nos cultures d’EPR, nous avons créé un nouveau type de test de phagocytose appelé capacité totale de consommation.
Ce test nous permet de déterminer la capacité totale de l’EPR à phagocyter les segments externes tout en évitant certaines des interprétations confondantes qui accompagnent les tests classiques de phagocytose par pouls. Nous sommes ravis d’utiliser ce modèle d’accumulation de matériaux de type lipofuscine pour mieux comprendre quels facteurs de stress RPE peuvent amener la lipofuscine normalement inerte à jouer un rôle plus pathologique dans la mort des cellules EPR.
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Aperçu
Cette recherche porte sur les effets de l'accumulation de lipofuscine dans des cultures humaines hautement différenciées de cellules épithéliales pigmentaires de la rétine (RPE), offrant des aperçus sur la toxicité de la lipofuscine et sur ses relations avec la physiologie des RPE. L'étude présente des protocoles nouveaux qui améliorent l'analyse des effets de la lipofuscine, tout en utilisant un dosage innovant de phagocytose afin d'évaluer la capacité totale de consommation des segments externes par les RPE.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Physiologie rétinienne
- Dégénérescence rétinienne liée à l'âge
Contexte
- L'accumulation de lipofuscine se produit dans l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) avec l'âge, ce qui complique l'évaluation de la toxicité.
- Les modèles in vitro reproduisent une accumulation semblable à celle de la lipofuscine pour les études de toxicité.
- Le maintien de cultures différenciées de RPE est essentiel pour une modélisation précise.
Méthodes utilisées
- Accumulation in vitro de matériel analogue à la lipofuscine dans des cultures matures de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes.
- Modèles de cellules humaines épithéliales pigmentaires rétiniennes.
- Dosage de la capacité phagocytaire totale par consommation.
Résultats principaux
- Développement de cultures de RPE hautement différenciées résistantes à la toxicité de la lipofuscine.
- Un nouvel essai permet de réévaluer l'efficacité de la phagocytose des segments externes.
- Identification des conditions dans lesquelles la lipofuscine devient pathogène.
Conclusions
- L'étude démontre le potentiel des modèles in vitro pour étudier les facteurs de stress des EPF liés au lipofuscine.
- Les résultats contribuent à la compréhension des mécanismes de dégénérescence rétinienne et des cibles thérapeutiques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La modélisation précise de l'accumulation de lipofuscine et de la phagocytose dans des cultures d'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) humain comble une lacune critique dans la compréhension de la dégénérescence rétinienne liée à l'âge et de la maladie de Stargardt. L'introduction de modèles d'RPE hautement différenciés et de tests quantitatifs permet une détection mécanistique des risques et une prédiction fiable au stade précoce de la découverte thérapeutique. Ces avancées soutiennent les décisions stratégiques en clarifiant les voies pertinentes pour la maladie et la validation fonctionnelle des cibles en biologie rétinienne.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet d'étudier les mécanismes de toxicité de la lipofuscine dans des systèmes de RPE humain physiologiquement pertinents.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles en modélisant les voies de phagocytose et de dégradation associées aux maladies.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques pour les interventions candidates ciblant un dysfonctionnement de la RPE.
Développement de tests et criblage
- Fournit des cultures de RPE validées et hautement polarisées pour des tests de composés reproductibles.
- Présente des dosages quantitatifs de la « capacité de consommation totale » permettant une mesure robuste de l'efficacité de la phagocytose.
- Permet la standardisation et la montée en échelle pour le criblage à haut contenu de modulateurs de la fonction de la RPE.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec des critères d'évaluation pertinents pour la maladie observés dans la dégénérescence rétinienne humaine.
- Facilite le développement de biomarqueurs translationnels en quantifiant le dysfonctionnement phagocytaire lié à l'accumulation de lipofuscine.
- Améliore la progression des candidats thérapeutiques ciblant la santé de l'épithélium pigmentaire rétinien, ajustée au risque.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthodologie s'intègre dès la phase de découverte jusqu'à l'identification de composés candidats, offrant une continuité pour les études mécanistiques et le criblage quantitatif dans les modèles de maladies rétiniennes.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur la toxicité de la lipofuscine et les voies de stress des cellules épithéliales pigmentaires de la rétine (RPE).
- Écrans de sélection : Fournit des tests de phagocytose reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Offre des images spectrales et des analyses par immunobuvardage (Western blot) pour l'analyse comparative de la fonction RPE.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les connaissances mécanistiques in vitro et les modèles précliniques de maladies.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour la modélisation de maladies liées à la RPE et le développement de tests.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles rétiniennes.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des tests sur les EPR.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et réduit les risques biologiques tardifs dans les portefeuilles rétiniens.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des programmes thérapeutiques ciblant les EPR.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les protocoles de culture et de différenciation des CPE humaines.
- Exige un accès à une infrastructure d'imagerie confocale et d'analyse par immunotransfert (Western blot).
- Implique une standardisation interéquipes des dosages de quantification de la phagocytose et de l'autofluorescence.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les sources de CPE ou les modèles de maladie.
- L'interprétation de la toxicité de la lipofuscine dépend du modèle utilisé et pourrait ne pas refléter entièrement la complexité in vivo.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:42
Preparation of Photo‐Oxidized Outer Segment Tips and Fragments
6:27
Characterization of the Lipofuscin‐Like Granule Spectrum and Composition
8:26
Assessing the Effects of Lipofuscin‐Like Granules on RPE Phagocytosis: Total Consumptive Capacity
