Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Cette procédure évalue les effets des petites GTP-ACÉ sur le trafic membranaire polarisé. Dans un premier temps, co-injectez des plasmides d'ADN codant pour la petite GTP-ACÉ et les protéines rapporteuses dans les noyaux cellulaires de cellules polarisées. Ensuite, exprimez l'ADN à des températures permettant d'arrêter les protéines rapporteuses dans le réticulum endoplasmique ou dans le TGN, tandis que la petite GTPA s'accumule dans le cytosol, puis poursuivez le trajet de la protéine rapporteuse jusqu'à la surface cellulaire en présence de cycloheximide afin d'empêcher toute nouvelle synthèse protéique.

Enfin, marquer la protéine rapporteur à la surface cellulaire pour une analyse en immunofluorescence. Les résultats obtenus grâce à ce dosage permettent de visualiser le changement de localisation à la surface par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la transfection, est qu'au cours des courtes périodes d'expression surexprimée obtenues par micro-injection, les effets secondaires sont minimes, ce qui nous permet d'étudier les effets primaires des protéines d'intérêt.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la polarité cellulaire, comme la manière dont la petite GTPase régule le trafic membranaire polarisé. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes individuelles nécessaires à une microinjection réussie sont difficiles à expliquer sans support visuel. Isolez l'ADN plasmidique exempt d'endotoxines à l'aide du kit maxi prep exempt d'endotoxines de Sigma Aldrich, conformément au protocole du fabricant. Pour cette expérience, utilisez trois filtres transwell clairs de 12 millimètres et de 0,4 micromètre de taille de pore pour la culture.

Les cellules sont ensemencées à raison de quatre fois dix puissance cinq cellules MDCK sur chaque filtre. Après deux jours, examiner la culture au microscope afin de vérifier que les cellules forment une monocouche continue. Pour la microinjection.

Le jour de la microinjection, préparez des boîtes de 360 par 15 millimètres contenant cinq litres de milieu de croissance MM supplémenté de 15 millimètres de heis, et placez-les dans une étuve à 39 degrés Celsius. En outre, préparez trois plaques de 12 puits contenant un millilitre de milieu de croissance MEM supplémenté de 50 millimolaire de heis et de 0,1 milligramme par millilitre de cycloheximide, puis placez-les dans une étuve à 31 degrés Celsius. Allumez le microscope de microinjection, configuré avec ce microscope inversé équipé d'une platine chauffante, d'objectifs 10 x et 32 x, et d'un Einor FemtoJet.

Régler la platine chauffante à 39 degrés Celsius. Ouvrir également l'alimentation en gaz azote vers la table à air. Diluer maintenant l'ADN avec de l'eau filtrée jusqu'à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre.

Ensuite, centrifuger l'ADN dans une microcentrifugeuse einor à 13 000 tr/min pendant 30 minutes. Retirer la partie supérieure et la placer dans un nouveau tube. Préparer ensuite les cellules MDCK en retirant le premier filtre de sa boîte de culture à l’aide de la lame chirurgicale, découper le filtre du support et le placer dans la plaque préparée de 60 par 15 millimètres contenant cinq millilitres de milieu de croissance MEM réchauffé à 39 degrés Celsius, supplémenté de 50 millimolaire de heis.

Pour maintenir le filtre en place dans la plaque de culture, placer la lame chirurgicale au centre du filtre, puis transférer la plaque de culture sur le plateau chauffant du microscope. Charger deux à trois microlitres de l'ADN dilué dans une micropipette d'injection. Tourner le couvercle de protection de la micropipette et le laisser tomber au sol.

Pour positionner l'aiguille dans le porte-aiguille, appuyez sur la touche menu de l'injecteur et assurez-vous que la vanne est fermée. Vissez l'aiguille dans son support. Attention à ne pas visser l'aiguille trop fermement.

Étant donné que cela pourrait entraîner une rupture, appuyez à nouveau sur la touche du menu. Ainsi, la pression de compensation appliquée empêchera le milieu d'être aspiré dans l'aiguille pendant la procédure de microinjection. Enfin, actionnez le joystick pour effacer le positionnement mémorisé et abaisser l'aiguille sur les cellules.

Utilisez l'objectif 10 x et amenez l'aiguille dans le faisceau lumineux au-dessus du liquide. Mettez maintenant au point sur les cellules. Remontez à nouveau en tournant la molette de mise au point de 180 degrés vers le haut et repérez l'aiguille.

Déplacez lentement l'aiguille jusqu'à ce qu'elle soit nette. Ensuite, retirez-la à nouveau du plan de netteté. Travaillez ensuite à remettre les cellules au point.

Ramenez l’aiguille au point de netteté. Répétez jusqu’à ce que l’aiguille touche la surface du milieu, moment où un halo est observé. Continuez jusqu’à ce que les cellules soient au point, mais que l’aiguille reste floue en dehors du plan focal.

Passer maintenant à l'objectif 32 x et trouver les réglages grossiers. Définir la limite Z en touchant la membrane apicale avec l'extrémité de l'aiguille et en soustrayant environ 10 micromètres, les noyaux étant situés à environ 10 micromètres sous la membrane apicale.

Maintenant, sortez l’aiguille de quelques microns du plan focal aussi rapidement que possible. Visez avec l’aiguille au-dessus du noyau et appuyez brièvement sur le bouton d’injection du joystick. Commencez à 95 PSI pour trouver la pression d’injection appropriée.

Si la pression est trop élevée, les cellules éclatent. Si la pression est trop faible, un point blanc persiste, mais rien d'autre ne se produit. Réalisez une injection réussie impliquant un changement de phase sans modification de la taille de la cellule.

Injectez de 100 à 500 cellules dans le trou de la lame chirurgicale qui repose sur les cellules. Ensuite, placez les cellules avec la boîte de culture et la lame chirurgicale dans un incubateur à 39 degrés Celsius et incubez pendant deux heures. Enfin, transférez les cellules dans la plaque de 12 puits préparée contenant un millilitre de milieu MEM additionné de 50 millimolaire de cycloheptadécan, 0,1 milligramme par millilitre, et incubez pendant deux heures à 31 degrés Celsius.

Afin d'éviter la décoloration du signal GFP exprimé, protégez les échantillons de la lumière en les recouvrant de papier d'aluminium pendant toutes les étapes ultérieures de marquage de surface. Placez les cellules dans une boîte de culture sur une plaque métallique posée sur de la glace et rincez-les. Une fois avec du PBS glacé plus plus, positionnez un morceau propre de paraforme sur la plaque métallique sur glace et déposez à l'aide d'une pipette des gouttes de 30 microlitres d'un anticorps reconnaissant le domaine ecto de la protéine d'intérêt.

Placez maintenant le filtre contenant les cellules à l’envers sur la goutte et ajoutez quelques gouttes d’anticorps sur la face arrière du filtre. Incubez une heure sur de la glace. Lavez les cellules trois fois avec du PBS glacé plus plus et fixez avec du paraformaldéhyde à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante.

Procédez au lavage des cellules une fois avec du PBS plus plus et équilibrez dans du PBS plus plus pendant cinq minutes. Incubez ensuite les cellules dans un tampon de blocage perméabilisant. Incubez une heure à température ambiante, diluez les anticorps primaires au 1/200 dans du BPB pour détecter la RAB GTPase exprimée, centrifugez pendant 10 minutes à 13 000 tr/min, puis pipetez 30 microlitres de la solution d'anticorps sur un parafilm propre placé dans une chambre humide.

Placer les cellules sur le filtre à l’envers sur les gouttes d’anticorps et incuber pendant une heure. À température ambiante, remettre les cellules à l’endroit dans une plaque de 12 puits et laver cinq fois sur 30 minutes avec du BPB à température ambiante après incubation avec les anticorps secondaires appropriés, en incluant une étape de lavage.

Immergez les cellules sur le filtre trois fois dans de l'eau déionisée et placez-les à l'endroit sur des lames microscopiques avec 10 microlitres de milieu de montage. Déposez un verre de couverture micro de 18 sur 18 millimètres par-dessus et, à l'aide de mouchoirs en papier, appuyez doucement sur le verre de couverture pour le fixer aux cellules. Enfin, scellez avec du vernis à ongles lors de l'injection factice contenant uniquement le plasmide codant pour V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La protéine est acheminée vers la surface basolatérale de cellules MDCK bien polarisées, comme en témoigne la coloration rouge de surface observée dans les cellules qui ne sont pas bien polarisées.

Une partie de la protéine de fusion GFP sera acheminée vers la membrane apicale. Si les échantillons témoins présentent cet aspect, les données ne sont pas fiables et l'expérience doit être répétée avec des cellules mieux polarisées. Notez que toute la protéine de fusion exprimée en GFP n'est pas acheminée vers la membrane basolatérale pendant la phase de poursuite à 31 degrés Celsius, comme en témoigne le signal vert intracellulaire étendu pour la protéine totale. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ 10 à 12 heures après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du trafic membranaire pour explorer les protéines régulatrices dans les cellules épithéliales polarisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer des protéines dans des cellules épithéliales polarisées en utilisant la technique de microinjection.