Procédé d’immobilisation verticale pour analyse de microscopie accélérée dans des cyanobactéries filamenteuses

Chez les bactéries, l’étude de la dynamique des protéines de division cellulaire nécessite une orientation spatiale des cellules. Par exemple, dans le cas de l’anneau Z, le composant principal de la division cellulaire bactérienne, une orientation verticale est fondamentale pour enregistrer toute la structure dans le plan XY. Dans cette vidéo, nous développons une méthode pour obtenir cette orientation particulière chez la cyanobactérie filamenteuse Anabaena.

Anabaena est un organisme photosynthétique multicellulaire, et partagent avec d’autres bactéries la capacité d’utiliser le diazote atmosphérique comme source d’azote. En l’absence de cet élément, Anabaena différencie les cellules spécialisées dans la fixation de l’azote. Par conséquent, il fournit un excellent modèle dans lequel analyser la relation entre la division cellulaire et la multicellularité.

Tout d’abord, sélectionnez un composant divisome présent dans la souche de cyanobactérie filamenteuse cible. Pour l’expérience, il est nécessaire de construire un mutant cyanobactérien filamenteux qui exprime le composant divisome sélectionné fusionné à une protéine fluorescente. Dans ce protocole, nous utilisons un mutant Anabaena qui exprime FtsZ fusionné à GFP comme exemple.

Tout d’abord, faites une nouvelle sous-culture du mutant avec 10 millilitres d’une culture en phase stationnaire et 90 millilitres de milieu liquide. Ensuite, cultivez la nouvelle culture cellulaire en lumière constante et à la température optimale, jusqu’à atteindre la phase exponentielle. Dans notre exemple, le mutant a été cultivé à 25 degrés Celsius pendant sept jours.

Maintenant, prenez deux millilitres de la culture de croissance et mettez-la dans un tube centrifugeur. Centrifuger à 2, 500 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, vérifiez que toutes les cellules sont au fond du tube.

Soyez prudent lors de la manipulation des échantillons, pour éviter la remise en suspension. Chauffer la solution d’agarose à 3 % à bas point de fusion au micro-ondes. Il est important de le faire à de courts intervalles de temps et de vérifier la solution jusqu’à ce qu’elle soit complètement liquide.

Une fois fondu, mettre de côté pour refroidir. Prenez les tubes centrifugés de l’étape précédente, jetez 1,9 millilitre du surnageant et remettez en suspension les cellules dans le volume restant en pipetant au moins trois fois de haut en bas. Sur votre lieu de travail, placez le tube avec les cellules, la solution d’agarose fondue, une seringue d’un millilitre coupée dans la pointe et un scalpel avec une lame neuve et propre.

Ensuite, mélangez les cellules avec 900 microlitres de la solution d’agarose à 3% en pipetant au moins trois fois. Il est vraiment important de s’assurer que la solution d’agarose n’est pas trop chaude, mais reste liquide. Avec cela, nous évitons les dommages cellulaires pendant ce processus.

L’étape suivante doit être faite rapidement et avant que la solution d’agarose ne se gélifie. Aspirez soigneusement la matrice d’agarose dans une seringue d’un millilitre. Il est important d’éviter la génération de bulles pendant que l’échantillon est aspiré.

Après cela, incuber l’échantillon, en plaçant la seringue en position horizontale à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, retirez soigneusement la matrice avec les cellules à l’aide du piston sur une surface propre et plane. À l’aide du scalpel, couper l’échantillon de gel en tranches aussi fines que possible, en maintenant l’intégrité de la matrice.

Déposez ensuite les échantillons dans la feuille de couverture correspondante, côte à côte. Comme le montre la vidéo, dans cette étape, vous pouvez utiliser un conseil pour vous aider dans le processus de manipulation de l’échantillon. Pour les expériences time-lapse, il est recommandé d’utiliser une chambre cellulaire conçue pour l’analyse microscopique.

Dans ce cas, nous utilisons des lamelles de recouvrement circulaires qui s’adaptent à ce type de chambres, comme vous pouvez le voir dans la vidéo. Enfin, pour éviter la déshydratation de l’échantillon, ajoutez un volume supplémentaire de solution d’agarose à 3% fondue à l’intérieur de la chambre. Avant l’imagerie, attendez que l’agarose soit complètement gélifiée.

Maintenant, mettez la chambre avec les cellules dans le microscope pour l’imagerie. Il est recommandé d’utiliser un équipement avec contrôle de la température et de l’humidité. Visualisez l’échantillon en champ clair avec un grossissement maximal et recherchez un filament orienté verticalement.

Vous pouvez trouver le site de division d’intérêt avec un balayage initial en utilisant le signal d’autofluorescence le long du plan Z. Avec cela, utilisez les paramètres de votre marqueur de protéine fluorescente pour visualiser le signal de votre protéine d’intérêt dans le site de division. Maintenant, vous pouvez effectuer des expériences time-lapse selon le modèle biologique et la protéine d’intérêt.

Dans ce cas, nous pouvons voir toute la structure de l’anneau Z dans le mutant FtsZ-GFP, dans le plan XY. Avec notre méthode, nous étions capables d’enregistrer la dynamique de ces anneaux sur une longue période de temps. Enfin, avec les changements d’intensité de fluorescence, nous concluons que cette structure est très dynamique dans notre modèle.

Cette méthode est un protocole rapide et peu coûteux pour enregistrer la dynamique des protéines dans le site de division au moyen de la microscopie confocale appliquée à des morphologies complexes en tant que cyanobactéries filamenteuses, en utilisant Anabaena comme modèle.