Générer des cellules iPS de MEFS travers l'expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

Il y a plus de 50 ans, on a émis l'hypothèse que des cellules différenciées terminales, telles que les fibroblastes cutanés, pourraient être forcées à adopter un état pluripotent similaire à celui des cellules souches embryonnaires. La base de ce concept repose sur l'observation que tous les types cellulaires, à quelques rares exceptions près, possèdent le même code génétique et que la seule différence entre les types cellulaires réside dans la manière dont ce code est lu. Cette capacité à modifier l'identité cellulaire d'une cellule différenciée pour la ramener à un état pluripotent est appelée reprogrammation cellulaire.

Après cinq années de recherche, il a récemment été démontré que l'expression forcée de quatre facteurs de transcription peut reprogrammer des fibroblastes cutanés pour les rendre pluripotents. L'impact de cette découverte est considérable. Au-delà de son importance pour la biologie fondamentale, elle permet également de contourner les principales objections éthiques liées à l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines en thérapie transplantatoire.

Pour que le reprogrammation se produise, quatre gènes codant pour les facteurs de transcription OC4, Sox2, c-Myc et K4 doivent être emballés et introduits dans une culture de tissus à l'aide d'un lentivirus. Un milieu contenant le virus purifié est ensuite ajouté à une boîte de culture cellulaire contenant une forte densité de fibroblastes, et dans cette boîte, un phénomène étonnant se produit. Une petite fraction des fibroblastes est infectée par les quatre virus porteurs des facteurs de transcription et commence à se dédifférencier.

Ils subissent des changements importants dans leur morphologie et leur prolifération, et commencent à se diviser en grands agrégats sphériques formés de cellules souches pluripotentes. Après deux à trois semaines de culture dans des conditions adaptées aux cellules souches embryonnaires, les colonies de fibroblastes reprogrammés peuvent être isolées manuellement et amplifiées in vitro. Une fois purifiées, ces cellules peuvent être utilisées pour générer des souris chimériques dans lesquelles un certain pourcentage de cellules, dérivé de ces fibroblastes dédifférenciés, peut contribuer à différents tissus de la souris.

Dans les chimères où le matériel génétique des fibroblastes d'origine a contribué à la lignée germinale, le code génétique peut être transmis à la génération suivante, puis à la suivante, et ainsi de suite. Bien que l'utilisation d'un système de livraison viral constitue actuellement un obstacle aux applications cliniques, cela devrait être rapidement surmonté. Dans cette vidéo, des membres du laboratoire Yin démontreront comment des cellules souches pluripotentes induites sont obtenues à partir de fibroblastes embryonnaires de souris.

Bonjour, je suis Grant Welted du laboratoire de Rudolph Jish à l'Institut Whitehead pour la recherche biomédicale à Cambridge, dans le Massachusetts. Et je suis Tobias Bro brink, également du laboratoire Iš. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la génération de cellules souches pluripotentes induites par l'introduction de quatre ADNc OCT4, SOX2, c-MYC et KLF4 à l'aide de lentivirus exprimant ces quatre ADNc sous un promoteur Tet-O-CMV.

Ceci permet un contrôle précis de l'expression de ces quatre transgènes après l'infection de fibroblastes embryonnaires de souris. Le protocole que nous vous présentons aujourd'hui implique la manipulation de lentivirus pouvant éventuellement infecter des cellules humaines. Il est essentiel que vous suiviez toujours des procédures sécuritaires et que vous contactiez votre service de sécurité avant de tenter de réaliser cette manipulation vous-même.

Alors, générons des cellules IPS afin de produire un lentivirus qui permettra de convertir les cellules ME en cellules IPS. Les cellules 293 doivent être transfectées avec trois plasmides : Paks deux, qui fournit les éléments génétiques nécessaires à l'encapsidation virale ; l'ADN squelette viral, qui est un lentivirus FUW TE OCMV portant l'un des quatre facteurs CD aids T quatre, SOX deux, KLA quatre ou CMIC ; et PMDG, qui exprime la glycoprotéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire, ou VSV.

Cela permet de produire le virus qui générera le virus atropique. Par conséquent, il est nécessaire de suivre les procédures appropriées de niveau de biosécurité 2 plus. Dans cette vidéo particulière, nous ne manipulons pas réellement de virus infectieux ; ainsi, nous ne portons pas nos blouses habituelles et ne nous trouvons pas dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 plus.

Avant la transfection 2, les cellules 9 3 sont décongelées à partir d'azote liquide et cultivées jusqu'à une confluence de 90 %. Les cellules sont ensuite transfectées avec le gène FU et incubées 48 à 72 heures pour permettre l'expression du virus. À ce stade, le milieu entourant les cellules est filtré à l'aide d'un filtre de 0,45 micron, puis concentré par ultracentrifugation après concentration du virus. Nous sommes désormais prêts à infecter les MES afin de générer des agrégats IPS. Pendant les étapes de préparation virale, des fibroblastes embryonnaires de souris ayant subi moins de trois passages sont cultivés jusqu'à une confluence de 90 % dans des boîtes de 10 centimètres, soit environ deux fois 10 à la puissance 6 cellules par boîte. Dans ce protocole expérimental particulier, nous utilisons des MES exprimant la RTTA, ce qui est essentiel pour l'expression de la doxycycline et de la GFP à partir du locus endogène OC quatre.

Les MES sont négatifs pour la GFP, mais les véritables cellules IPS deviennent positives pour la GFP. Ce marqueur permet une méthode permettant d'identifier les cellules reprogrammées. Aspirez le milieu de culture des fibroblastes et rincez avec 10 ml de HBSS, EDTA, jetez le HBSS, EDTA et ajoutez 5 ml de trypsine 1X, puis incubez à 37 degrés pendant 10 minutes. La trypsine aidera à détacher les cellules du fond des boîtes.

Ajoutez maintenant neuf millilitres de milieu de culture pour resuspendre les cellules en une suspension monocellulaire et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Ces cellules sont ensuite centrifugées et misent en pellet. Après la resuspension du dépôt, le nombre de cellules dans la suspension est déterminé et la concentration est ajustée à huit fois dix puissance quatre cellules par millilitre.

10 mils de la suspension cellulaire sont ensuite transférés dans une boîte de 10 centimètres revêtue de gélatine. Incuber la boîte toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % CO2 ; après l'incubation nocturne, le milieu provenant d'une boîte de fibroblastes est aspiré et 10 mils de milieu contenant le virus sont ajoutés au méth. Incuber les cellules de quatre heures à toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % CO2.

Le lendemain, aspirez le milieu d'une boîte de fibroblastes, puis ajoutez 10 mils de milieu ESL frais. À ce stade, les cellules peuvent être congelées, mises en culture pour expansion ou préparées pour l'initiation de la reprogrammation. Pour initier la reprogrammation, remplacez le milieu ESL ordinaire par un milieu contenant de la doxycycline afin de déclencher l'expression des quatre gènes.

Placer ces cellules dans l'incubateur et changer le milieu chaque jour jusqu'à ce que les colonies deviennent suffisamment grandes pour être prélevées. Les colonies devraient devenir visibles environ une semaine après le début de la reprogrammation. Elles devraient atteindre une taille suffisante pour être prélevées vers le jour 20.

À présent que 20 jours se sont écoulés, nous pouvons procéder à la sélection des colonies IPS avant de choisir les colonies. Il faut se rappeler de prévoir le nombre requis de plaques de 24 puits revêtues de gélatine et traitées par irradiation gamma avec des DR quatre mythes une à deux heures avant la sélection. Il faut nourrir les colonies sur les plaques en ajoutant du milieu frais juste avant la sélection, ajouter 50 microlitres de tampon HEPA dans les puits d’un plat de 96 puits à fond en V immédiatement avant la sélection, rincer le plat contenant les colonies à sélectionner une fois avec du PBS et ajouter 10 ml de PBS au plat. Les agrégats de cellules IPS peuvent être sélectionnés soit au microscope stéréo, soit au microscope inversé.

Prélevez les colonies à l’aide d’une petite pointe de pipette et transférez-les dans un puits de la plaque de 96 puits contenant du PBS afin d’éliminer les agrégats. Un cercle est tracé avec la pointe de pipette autour de l’agrégat pour disperser les masses. Les cellules reprogrammées peuvent maintenant être prélevées à l’aide de la pipette multipuits ; 20 microlitres de trypsine sont ajoutés à chaque puits.

Pipetez vers le haut et vers le bas trois fois, incubez à 37 °C pendant quatre minutes. Après l'incubation de quatre minutes, ajoutez 100 µL de milieu ES aux colonies triées. Pipetez vers le haut et vers le bas dix fois et transférez six clones à la fois.

Transférer les cellules d'une plaque de 96 puits vers une plaque de 24 puits à l'aide d'une pipette à 12 canaux en utilisant une pointe à chaque autre position. Ensuite, cultiver les cellules sur la plaque de 24 puits dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO₂, jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, en renouvelant régulièrement le milieu pour cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules seront probablement prêtes à être mises en culture élargie dans un délai de trois à sept jours. Quelques jours plus tard, une fois que les cellules IPS sont confluentes, aspirer le milieu et laver les cellules avec 1 mL de HEPES. Retirer complètement le HEPES, puis ajouter 100 µL de trypsine 1X et incuber à 37 °C pendant 10 minutes. Après l'incubation avec la trypsine, ajouter 400 µL de milieu ESL et resuspendre les cellules en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin d'obtenir une suspension monocellulaire.

La suspension simple de cellules de 500 microlitres provenant de la plaque 24 puits est ensuite transférée dans un seul puits d'une plaque 6 puits et incubée dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % dans la plaque 6 puits. À ce stade, vous pouvez soit procéder à l'amplification des cellules pour des analyses de Southern, des essais sur des blastocystes, des injections, des essais de tératomes ou des essais de différenciation in vitro. Vous devez également penser à congeler des stocks de ces cellules afin de ne pas perdre cet échantillon précieux de cellules IPS.

Nous venons de vous montrer comment induire la pluripotence dans des fibroblastes embryonnaires de souris à l'aide d'un système antiviral inductible. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.