Analyse immunoblot

Le transfert immuno-enzymatique, souvent appelé immunobuvardage ou « Western blot », sert à identifier, au sein d'un échantillon protéique, des antigènes spécifiques reconnus par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Cette procédure suit généralement une électrophorèse sur gel unidimensionnelle ou bidimensionnelle, et implique le transfert des protéines séparées sur des membranes en nitrocellulose. L'incubation de ces membranes avec des anticorps primaires puis secondaires, directement ou indirectement conjugués à des enzymes, permet la visualisation des antigènes protéiques par réactions colorimétriques ou fluorescentes à l'aide de substrats spécifiques.

Dans cette vidéo, nous présentons une démonstration étape par étape d'une procédure de transfert immunologique. Bonjour, je suis Sean Gallagher de l'UVPI, en collaboration avec un centre protéomique ici à l'Institut Supérieur KE. Aujourd'hui, je vais vous montrer l'analyse par transfert immunologique.

Elle implique plusieurs étapes, notamment la séparation des protéines, leur transfert sur des membranes, la détection immunologique et la visualisation à l’aide de substrats chromogènes et de substrats chimiluminescents. Commençons donc. Avant d’entamer la procédure de transfert immunologique, les échantillons protéiques doivent d’abord être séparés par électrophorèse en utilisant des gels de petite ou de taille standard, unidimensionnels ou bidimensionnels.

Préparez les échantillons antigéniques et chargez-les dans les puits du gel, en incluant une protéine prémarquée ou biotinylée et des standards de poids moléculaire dans un ou plusieurs puits du gel. Ces marqueurs protéiques seront transférés sur la membrane et indiqueront utilement l'orientation de la membrane ainsi que les tailles des protéines après immunomarquage. Une fois l'électrophorèse terminée, nous sommes prêts à assembler le blot immuno.

Pour monter le blot immuno, commencez par désassembler le sandwich de gel et retirez le gel de concentration. Équilibrez le gel pendant 30 minutes à température ambiante dans du tampon de transfert. Cette étape d'équilibration est nécessaire pour éviter tout changement de taille du gel pendant le transfert. Pendant que le gel s'équilibre, commencez à monter le sandwich de transfert dans un plateau suffisamment grand pour contenir la cassette de transfert en plastique. Remplissez-le de tampon de transfert afin que la cassette soit recouverte. Placez ensuite un tampon Scotch-Brite ou une éponge sur la moitié inférieure de la cassette de transfert en plastique.

Ensuite, prendre une feuille de papier filtre découpée à la même taille que le gel. L'humidifier avec du tampon de transfert et la placer sur le tampon Scotch-Brite. Une fois l'équilibration du gel de 30 minutes terminée, poser le gel sur le papier filtre.

Éliminez toute bulle d'air entre le gel et le papier filtre en roulant délicatement un tube à essai ou une tige en verre sur la surface du gel. Vous pouvez également utiliser le rouleau BioRad, fourni avec le kit BioRad. N'oubliez pas d'utiliser des gants lors de la manipulation des papiers filtres, des gels et des membranes.

L'huile de vos mains bloquera le transfert. Ensuite, préparez la membrane de transfert. Découpez la membrane à la même taille que le gel, en ajoutant un à deux millimètres sur chaque bord.

Ensuite, placer lentement la membrane dans de l'eau distillée en l'insérant par un bord à un angle de 45 degrés ; l'eau remontera par capillarité dans la membrane et finira par mouiller toute la surface. Si elle est insérée trop rapidement dans l'eau, de l'air risque d’être piégé et apparaîtra sous forme de taches blanches sur la membrane. Les protéines ne se transféreront pas sur ces zones.

Une fois que la membrane est complètement mouillée, l'équilibrer de 10 à 15 minutes dans le tampon de transfert. Cette procédure d'humidification fonctionne pour les membranes en nitrocellulose et en nylon. Seules les membranes en PVDF sont hydrophobes et ne s'humidifient pas simplement en les plongeant dans de l'eau distillée ou dans le tampon de transfert.

Les membranes en PVDF doivent d'abord être immergées dans du méthanol à 100 % pendant une à deux secondes, puis équilibrées de 10 à 15 minutes dans du tampon de transfert. Ne laissez jamais la membrane sécher à aucun moment.

Si cela se produit, humidifiez à nouveau avec du méthanol, puis avec le tampon de transfert. Une fois la membrane prête, placez-la directement, préalablement humidifiée, sur la face supérieure du gel. Veillez à éliminer toutes les bulles d'air entre le gel et la membrane en roulant délicatement un tube à essai, une tige en verre ou un rouleau BioRad sur la surface de la membrane.

Humidifiez ensuite une autre pièce de papier filtre Watman de 3 mm. Placez-la ensuite par-dessus la membrane et retirez à nouveau toutes les bulles d'air. Puis, placez un autre tampon Scotch-Brite ou une éponge par-dessus ce papier filtre.

Terminez le montage du sandwich du blot immuno en verrouillant la moitié supérieure de la cassette de transfert en place. Maintenant que le sandwich du blot immuno est assemblé, nous sommes prêts à transférer les protéines du gel vers la membrane. Pour commencer la procédure de transfert, remplissez le réservoir d’immunotransfert avec du tampon de transfert et placez la cassette contenant le sandwich dans l’appareil d’immunotransfert.

Il est important de placer le sandwich de sorte que la membrane soit orientée vers l'anode ou le côté positivement chargé du réservoir. Connectez les câbles de l'alimentation électrique aux côtés correspondants de l'anode et de la cathode de l'appareil de transfert électrophorétique. Ce transfert particulier est équipé d'un bloc de glace pour le refroidissement.

À présent, transférez électrophorétiquement les protéines du gel vers la membrane pendant 30 à 60 minutes à 50 volts avec refroidissement, ou pendant toute une nuit à 14 volts dans une chambre froide. Une fois le transfert terminé, éteignez l'alimentation électrique et démontez l'appareil. Ensuite, retirez la membrane de l'appareil de transfert et notez l'orientation en découpant un coin.

À ce stade, les membranes peuvent être séchées et conservées dans un sac en plastique refermable à quatre degrés Celsius pendant un an. Avant tout traitement ultérieur, les membranes en PVDF séchées doivent être placées dans une petite quantité de méthanol à 100 % afin d'humidifier la membrane, puis dans de l'eau distillée pour éliminer le méthanol.

Une fois l'orientation marquée, colorer le gel pour vérifier l'efficacité du transfert. Pour visualiser les protéines transférées, vous pouvez soit colorer la membrane de manière réversible avec le rubis cipro, soit de manière irréversible avec l'encre de Chine bleue kamasi, le bleu de naphthol ou l'or colloïdal. Ces procédures de coloration irréversibles sont incompatibles avec les membranes en nylon.

À présent que les protéines ont été transférées sur la membrane, procédez au sondage immuno et à la détection visuelle des protéines. Dans cette étape, les protéines immobilisées sur la membrane sont mises en présence d'anticorps spécifiques afin d'identifier et de quantifier les antigènes présents. Pour commencer, placez la membrane dans un plateau d'incubation en plastique contenant 20 millilitres de tampon de blocage.

Certaines personnes utilisent des sachets, mais les barquettes sont souvent préférées car elles sont particulièrement utiles lors du traitement d'un grand nombre de bandes dans différentes solutions d'anticorps primaire. Incubez ensuite la membrane scellée de 30 à 60 minutes à température ambiante sous agitation sur un agitateur orbital ou une plateforme basculante. Pendant l'incubation de la membrane, diluez l'anticorps primaire dans le tampon de blocage.

La dilution est déterminée de façon empirique, mais est généralement comprise entre un à cent et un à mille. Pour un anticorps polyclonal, entre un à dix et un à cent pour les surnageants d'hybridomes, et supérieure à un à mille pour les liquides acides murins contenant des anticorps monoclonaux. Une fois l'incubation terminée, versez le tampon de blocage.

Remplacez le tampon par l'anticorps primaire dilué, puis incubez à nouveau pendant 30 à 60 minutes à température ambiante sous agitation constante. Ensuite, lavez la membrane quatre fois en agitant avec 100 millilitres de TTBS pour les filtres en NITROCELLULOSE ou en PVDF, ou de TBS pour les filtres en nylon.

Lors du lavage de la membrane, effectuez des lavages de 10 à 15 minutes chacun, tout en diluant l'anticorps secondaire dans le tampon de blocage. Des exemples d'anticorps secondaires comprennent la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline, les conjugués anti-Ig, disponibles commercialement sous forme d'enzymes conjuguées. Les anticorps secondaires sont généralement dilués d’un à 200 à un à 25 000 avant utilisation.

Une fois les étapes de lavage terminées et les solutions de lavage éliminées, ajouter la peroxydase de raifort diluée ou la phosphatase alcaline conjuguée anti-Ig et incuber de 30 à 60 minutes à température ambiante sous agitation constante. Après 30 à 60 minutes, retirer la membrane du bac et la laver quatre fois, 10 à 15 minutes à chaque fois, dans du TTBS comme décrit précédemment.

Une fois les lavages terminés, nous sommes prêts à passer à l'étape de visualisation. Mais tout d'abord, nous allons démontrer une procédure alternative de détection immunohistochimique. Cette procédure alternative de détection immunohistochimique est basée sur le kit de coloration A BC de Vector Labs.

Il utilise un complexe avidine-biotine pour fixer la peroxydase de raifort (HRPO) ou la phosphatase alcaline (AAP) à l'anticorps secondaire biotinylé. Aujourd'hui, nous allons démontrer l'utilisation du kit HRPO. Le TTBS est particulièrement adapté comme tampon de blocage pour les systèmes avidine-biotine.

Mais pour les filtres en nylon, des réactifs de liaison aux protéines sont recommandés, car le lait écrémé en poudre contient de la biotine résiduelle, qui interférerait avec le dosage immuno-enzymatique. Il doit être utilisé uniquement lors de l'étape de blocage, afin de commencer à équilibrer la membrane dans un tampon de blocage dans un récipient ouvert, sous agitation constante à l’aide d’un agitateur orbital ou d’une plateforme basculante. Incuber la membrane pendant 30 à 60 minutes à température ambiante, pendant que la membrane s’équilibre.

Préparez la solution d'anticorps primaire. Utilisez du TTBS pour les membranes en NITROCELLULOSE ou en PVDF avec des systèmes Aden biotine hautement sensibles.

La dilution de la solution contenant l'anticorps primaire varie généralement entre un sur 1000 et un sur 100 000. L'utilisation d'une chimie chimiluminescente nécessite des dilutions plus élevées. Dans notre cas, démonstration chromogénique.

Nous utilisons une dilution au 1/5 000 du primaire. Une fois l'équilibrage terminé, retirez le tampon de blocage. Ajoutez ensuite une quantité suffisante de solution d'anticorps primaire pour recouvrir la membrane.

Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante avec agitation douce après 30 minutes. Laver la membrane trois fois dans du TTBS pour nitrocellulose à des intervalles de cinq minutes. Pendant l'étape de lavage, préparer la solution d'anticorps secondaire biotinylé en diluant une goutte d'anticorps biotinylé avec 10 millilitres de TTBS. Une fois les étapes de lavage terminées, ajouter la solution d'anticorps secondaire.

Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante avec un mouvement lent de balancement pendant que la membrane est en incubation avec l'anticorps secondaire. Préparer l'avadon biotine HRPO pour effectuer cette étape. Mélanger deux gouttes du réactif A de la solution de coloration vti et deux gouttes du réactif B dans 10 millilitres.

TTBS pour la nitrocellulose. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante une fois l'incubation avec l'anticorps secondaire terminée. Laver la membrane trois fois en 15 minutes avec du TTBS ou du TBS.

Ensuite, ajoutez la solution enzymatique d'avidine biotine au membrane et incubez pendant 30 minutes à température ambiante avec un balancement lent. Lavez ensuite la membrane trois fois à des intervalles de 10 minutes avec du TTBS. Maintenant que la procédure de détection immunologique est terminée, les protéines liées à la membrane sont prêtes à être visualisées à l'aide de substrats chromogènes.

Pour cette dernière étape de visualisation, les substrats CN-DAB/ICL2 et TMB sont couramment utilisés avec des procédures de détection immunoenzymatique à base de peroxydase de raifort. Si le dernier lavage de la membrane au cours de la procédure d'hybridation immunologique a été effectué dans du TTBS, rincez la membrane pendant 15 minutes à température ambiante avec 50 millilitres de TBS. Placez ensuite la membrane dans la solution de visualisation chromogénique.

Les bandes protéiques devraient apparaître entre 10 et 30 minutes. Après une incubation de 30 minutes, éliminer le mélange réactionnel de substrat et arrêter la réaction en ajoutant de l'eau distillée. Le transfert immunologique est une procédure en plusieurs étapes utilisée par des milliers de laboratoires pour détecter la présence de protéines spécifiques après une électrophorèse unidimensionnelle ou bidimensionnelle.

Je viens de vous montrer comment effectuer une analyse sanguine immunologique. Voilà, c'est terminé. Bonne chance dans vos expériences et merci d'avoir regardé.