Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Les cellules souches ont la capacité remarquable de se différencier en de nombreux types cellulaires différents dans l'organisme. Elles jouent un rôle de système de réparation pour le corps. Elles peuvent théoriquement se diviser sans limite afin de renouveler d'autres cellules.

Lorsqu'une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a la capacité de rester une cellule souche ou de devenir un autre type de cellule doté d'une fonction plus spécialisée. Ce domaine de recherche prometteur pousse les scientifiques à explorer la possibilité de thérapies cellulaires pour traiter des maladies in vitro. La différenciation des cellules souches embryonnaires se produit lorsque les cellules sont autorisées à s'agréger en culture en suspension.

En l'absence d'embryons de souris, de fibroblastes nourriciers et de facteur inhibiteur de la leucémie, ces agrégats cellulaires sont appelés corps embryonnaires. La méthode de la goutte suspendue est une procédure efficace pour la différenciation des cellules souches en corps embryonnaires in vitro. Bonjour, je suis Sha Juan du laboratoire de Lefty dans la division de médecine cardiovasculaire de l'Université Stanford.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant la différenciation individuelle de cellules souches embryonnaires en embryons corporels selon la méthode du goutte-à-goutte manuel. Nous utilisons généralement cette méthode pour différencier les cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes. Cette procédure comprend les étapes suivantes : préparer une suspension monocellulaire de cellules souches embryonnaires, générer des cultures en gouttes manuelles, transférer les cultures en gouttes manuelles vers des plaques à adhérence ultra faible, puis ensemencer les embryons corporels sur des plaques revêtues de gelée de jus.

Très bien, commençons. La première étape de la procédure consiste à préparer une suspension monocellulaire de cellules souches embryonnaires. Étant donné que nous cultivons nos cellules souches embryonnaires non différenciées en les faisant croître sur des fibroblastes embryonnaires de souris, nous devons détacher les cellules et les séparer des fibroblastes.

Pour ce faire, nous réalisons une trypsination des cellules en utilisant des procédures standard. Une fois le traitement à la trypsine terminé, ajoutez du milieu pour cellules souches embryonnaires de souris afin de neutraliser la trypsine. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.

Ensuite, dispersez les colonies cellulaires en pipetant plusieurs fois vers le fond du tube jusqu'à l'obtention d'une suspension fine de cellules sans agrégats visibles. Centrifugez maintenant les cellules à 1 000 tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 10 mL de milieu pour cellules souches embryonnaires de souris.

Transférez la suspension cellulaire dans un flacon T 75 préalablement recouvert de gélatine à 0,1 % et incubez à 37 degrés avec 5 % de CO2 pendant une heure. Après une heure, les fibroblastes se sont fixés au plateau, mais les cellules souches restent dans le milieu. Prélevez le milieu à l’aide d’une pipette pour récupérer les cellules souches.

Faire centrifuger les cellules à mille tr/min pendant cinq minutes et aspirer le milieu. Ensuite, ajouter 10 mL supplémentaires de milieu de différenciation, puis resuspendre les cellules par pipetage répété jusqu’à l’obtention d’une suspension fine de cellules. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Nous sommes maintenant prêts à cultiver la suspension cellulaire selon la méthode de la goutte pendante. Pour commencer la culture en goutte pendante, utilisez le milieu de différenciation afin de diluer la suspension de cellules souches à une concentration de 500 cellules par 20 microlitres. Ensuite, retournez le couvercle d'une plaque de culture tissulaire de 150 millimètres.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de la suspension cellulaire sur la surface interne du couvercle de la plaque. À l'aide d'une pipette multicanal, ajoutez 10 mils de PBS sur la plaque. Retournez rapidement le couvercle de la plaque et placez-le délicatement sur la plaque afin de former les gouttes suspendues.

Une fois le couvercle de la plaque en place, transférez délicatement la plaque dans l'incubateur pour la culture. Laissez les cellules au repos pendant deux jours. Une fois l'incubation terminée, nous passerons au transfert de la culture en goutte pendante dans des plaques à adhérence ultra faible.

Après deux jours, retournez soigneusement le couvercle de la plaque, puis aspirez 180 microlitres de milieu de différenciation frais et déposez plusieurs gouttes dans une plaque de 96 puits à adhérence ultra faible. Ensuite, prélevez les gouttes à l’aide d’une pipette et transférez-les une par une dans la plaque de 96 puits. Placez les plaques dans l’incubateur sans les perturber pendant trois jours.

Les embryons continueront à croître en formant une structure sphérique. Une fois l'incubation terminée, nous serons prêts à ensemencer les embryons. Afin de favoriser la poursuite de leur différenciation.

Nous les transférons dans une plaque de 48 puits revêtue de gélatine. Pour ce faire, nous recouvrons d'abord chaque puits de la plaque avec 300 microlitres de gélatine à 0,1 %. Après l'ajout de la gélatine, incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, aspirez la gélatine de la plaque à 48 puits. Ajoutez ensuite 300 microlitres de milieu de différenciation à chacun. Transférez maintenant un par un les embryons sphéroïdes de la plaque à 96 puits vers les plaques à 48 puits revêtues de gélatine.

Nous changeons généralement le milieu le lendemain, puis tous les deux jours afin de maintenir les cellules. Nous utilisons cette méthode pour rechercher de meilleurs protocoles de différenciation des cellules souches embryonnaires. Dans les cardiomyocytes, nous venons de vous montrer comment réaliser une différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris par cultures en goutte suspendue.

Cette méthode est efficace parce que le fond arrondi de la goutte suspendue permet l'agrégation des cellules souches embryonnaires, créant ainsi un bon environnement pour la formation des corps embryonnaires. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le nombre de cellules souches embryonnaires agrégées dans une goutte suspendue peut être contrôlé en faisant varier le nombre de cellules dans la suspension cellulaire initiale. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.