Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

L'objectif général de cette procédure est de différencier des cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires de souris sur des fibroblastes embryonnaires primaires de souris, en supplémentant avec le facteur d'inhibition de la leucémie. Ensuite, améliorez le processus de normalisation en ajoutant la nogggine, le BFG F et le FGF huit, puis induisez la spécification des neurones moteurs par incubation avec l'acide rétinoïque et un agoniste de smoothened, suivie d'une élongation des axones et de la maturation des neurones moteurs.

Enfin, utilisez la microscopie en immunofluorescence pour examiner les cellules MES différenciées qui expriment une forte fluorescence GFP. La production de grandes quantités de neurones moteurs a facilité la recherche sur les maladies des neurones moteurs par rapport aux protocoles actuels existants. Cette approche de différenciation de cellules souches embryonnaires murines en neurones moteurs est plus efficace. Cette méthode peut fournir des informations sur l'atrophie musculaire spinale.

Il peut également être appliqué à d'autres maladies des motoneurones, telles que la sclérose latérale amyotrophique. Pour ensemencer des fibroblastes primaires embryonnaires de souris, recouvrir quatre boîtes de culture tissulaire de 100 millimètres avec huit millilitres de solution de gélatine à 0,1 %. Après 30 minutes à température ambiante, éliminer le liquide excédentaire. Diluer ensuite un flacon de mitomycine C dans le PMEF activé et compléter à 40 millilitres avec le milieu PMEF, répartir sur les quatre boîtes et cultiver jusqu'à une semaine.

Ensuite, décongeler un flacon de cellules MES dans un bain-marie à 37 degrés. Laver les cellules avec cinq millilitres de milieu E ES dans un tube de 15 millilitres. Après une centrifugation à 800 tr/min pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules MES dans 20 millilitres de milieu ES contenant du facteur inhibiteur de leucémie fraîchement ajouté. Procédez ensuite à l’élimination de 10 millilitres de milieu des cultures PMEF et remplacez-les par 10 millilitres de la suspension de cellules ES HBG trois. Surveillez l’évolution des cellules MES au fil du temps, passant de petites colonies à 24 heures à des colonies d’environ 100 micromètres de diamètre à 72 heures après la mise en culture.

Changer le milieu quotidiennement afin de maintenir la prolifération des cellules pour l'induction des cellules de type ESM. Différenciation en neurones moteurs. Les cellules souches embryonnaires de souris doivent d'abord être séparées des cellules nourricières PMEF, puis cultivées en milieu de suspension le jour de l'induction.

Pour chaque culture de cellules ES en plat de 100 millimètres, préparez un flacon T150 revêtu de gélatine à 0,1 %. Après 30 minutes à température ambiante, retirez l'excès de gélatine et rincez trois fois avec du PBS. Aspirez ensuite soigneusement le milieu de la culture de cellules ES, en veillant à ne pas détacher les colonies faiblement adhérentes. Rincez ensuite une fois avec 10 millilitres de PBS.

Maintenant, pour séparer les cellules MES des PMEF, ajouter trois millilitres de trypsine EDTA à 0,25 % et incuber pendant trois à cinq minutes. À 37 degrés Celsius, vérifier que les cellules souches et les PMEF se sont détachées de la plaque. Puis ajouter 15 millilitres de milieu ES frais et dissocier les colonies à l’aide d’une pipette.

Transférez la suspension cellulaire dans le flacon T150 préparé et revêtu de gélatine, puis incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius afin que les PFS adhèrent à la surface gélifiée. Récupérez maintenant les cellules MES en suspension dans un tube de 50 millilitres et faites-les précipiter par centrifugation. Resuspendez les cellules dans 10 millilitres de milieu de différenciation neuronale.

Compter le milieu à l'aide d'un hémocytomètre, puis le mettre en culture dans une boîte de culture en suspension de 100 millimètres pour l'induction de la différenciation. Au jour un, vérifier par microscopie que les cellules souches embryonnaires ont formé de petits agrégats flottants appelés corps embryonnaires. Étant donné qu'il peut y avoir des PMEF résiduelles attachées à la boîte, transférer les cellules souches en suspension ainsi que le milieu dans un tube de 15 millilitres, puis centrifuger à 500 tr/min pendant trois minutes.

Pour récolter les corps embryonnaires, aspirez soigneusement le milieu, ajoutez 10 millilitres de milieu frais de différenciation neuronale aux corps embryonnaires en culot, puis ensemencez les cellules dans une nouvelle boîte de culture bactériologique pendant 24 heures en conditions de différenciation. Au jour deux, agitez doucement la boîte de culture et transférez le milieu et les corps embryonnaires dans un tube de 15 millilitres. Laissez les corps embryonnaires se déposer par gravité, puis aspirez soigneusement le milieu et resuspendez les corps embryonnaires dans 10 millilitres de milieu de différenciation en neurones moteurs.

Cultiver le milieu EBS dans une nouvelle boîte bactérienne pendant cinq jours en conditions de différenciation. Au jour sept, vérifier que les EBS ont un diamètre d’environ 150 à 200 micromètres et expriment de forts signaux GFP en différenciation. Au jour cinq, deux jours avant la dissociation des EBS, placer des lamelles rondes de 12 millimètres au fond d'une plaque de 24 puits.

Ensuite, ajouter 0,5 millilitre de poly DL-ornithine à 100 microgrammes par millilitre et incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Aspirer le poly DL-ornithine, sécher à l'air les plaques et les lamelles dans une hotte de culture cellulaire. Rincer les puits de la plaque trois fois avec de l'eau doublement distillée.

Laisser sécher à l'air pendant un certain temps pour recouvrir les lamelles. Préparer une dilution fraîche de deux microgrammes par millilitre de laminine de souris dans cinq millilitres de PBS 1x glacé. Ajouter 0,5 millilitre par puits et incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit.

Laver deux fois avec du PBS lors de la différenciation. Au jour sept, recueillir les EBS dans un tube de 15 millilitres et laisser les EBS se déposer par gravité. Après quatre lavages avec du PBS, ajouter délicatement un millilitre d'ACU max aux EBS, mélanger doucement et incuber pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirer l'excès d'ACU max recouvrant les EBS.

Ajoutez maintenant trois millilitres de milieu MND et dissociez les EBS en pipetant environ 20 fois à l’aide d’une micropipette einor de un millilitre, puis incubez deux minutes à température ambiante. Faites passer la suspension cellulaire à travers un embout filtre dans un tube de 12 par 75 millimètres. Répétez cette étape de dissociation avec les agrégats restants et les cellules retenues par le filtre afin d’enrichir le rendement en cellules isolées dans une suspension finale de six millilitres composée de cellules uniques. Mélangez délicatement la suspension de cellules uniques et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluez les cellules dans du milieu MND complet jusqu’à une densité de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre de plaque.

0,5 millilitre de suspension cellulaire par puits des plaques 24 puits préparées contenant des lamelles revêtues de poly-DL-ornithine et de laminine. Les cellules différenciées étendent de longs neurites après deux jours. En culture, HBG trois est une lignée de cellules souches embryonnaires dérivée d'une souris transgénique exprimant EGFP sous le contrôle d'un promoteur spécifique des motoneurones, HB neuf, selon un protocole de différenciation défini.

Les cellules MES peuvent être utilisées pour obtenir des neurones moteurs. Les cellules MES non différenciées forment des colonies rondes à la surface d'une couche de cellules nourricières fibroblastes. Elles présentent une faible expression de la GFP.

Ces cellules MES ont été séparées des couches d'alimentation et cultivées dans des boîtes à faible attachement afin de former des corps embryonnaires. Les cellules MES différenciées ont exprimé une forte fluorescence GFP après le septième jour. Les EBS différenciés ont été dissociés et ensemencés sur des plaques revêtues de poly-DL-ornithine et de laminine.

Les cellules différenciées étendent de longs neurites à partir des corps cellulaires des cellules ensemencées après deux jours de culture ; les motoneurones dérivés de cellules MES peuvent être caractérisés par coloration en immunofluorescence. Ces cellules positives pour la GFP expriment le marqueur pan-neuronal neurofilamente et les deux marqueurs spécifiques des motoneurones. Eyelid one et la choline acétyltransférase, tandis que les colorations DPI marquent les noyaux, pris ensemble.

Notre protocole de différenciation en deux étapes offre un moyen efficace de différencier les cellules MES en neurones moteurs spinaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment différencier efficacement des cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. En conclusion, retenez qu'une qualité élevée des cellules souches embryonnaires de souris est le paramètre le plus critique pour générer efficacement des neurones moteurs.