Paradigmes pour la caractérisation pharmacologique de C. elegans mutants transmission synaptique

Bonjour, je suis Cody Locke du laboratoire Caldwell, département des sciences biologiques à l'Université de l'Alabama. Je suis Kyle Lee et je vais vous montrer comment préparer les vers pour les tests d'exposition à l'outta carb et au PTZ. Je suis Bernard Tu et je vais vous démontrer comment réaliser les tests d'outta carb.

Je suis Kaylin Berry et je suis responsable des vidéos sur C. elegans. Dans cette présentation, je servirai de narratrice et je démontrerai le test d'exposition à la PTZ. Aujourd'hui, mes collègues et moi allons montrer comment caractériser des mutants de la transmission synaptique à l'aide d'un modèle de l'épilepsie chez C. elegans après exposition à la PTZ et à l'aldecarbe, en utilisant une série de souches mutantes représentatives.

Commençons donc. Kyle Lee nous présentera aujourd'hui la préparation des dosages de glucides ALD lors du premier jour de la procédure. Veillez à ce qu'au moins 30 vers à stade adulte jeune de chaque génotype et de chaque réplicat soient disponibles pour les dosages de glucides ALD le deuxième jour.

Il est préférable qu'un expérimentateur sélectionne 50 vers ou plus au stade L4 sur des plaques NGM fraîches sans fongicide, ensemencées avec E. coli OP50 comme source alimentaire. Faire croître les vers pendant 12 à 24 heures à une température constante et permissive. Une température comprise entre 20 degrés Celsius et 22 degrés Celsius est idéale, bien qu'une température de 25 degrés Celsius soit acceptable.

Le deuxième jour, préparez une solution mère à 100 millimolaire d'Al Decarb et de l'éthanol à 70 %, puis répartissez la quantité appropriée d'Al Decarb sur des plaques NGM. Nous utilisons systématiquement 0,5 millimolaire d'Al Decarb en déposant 37,5 microlitres d'Al Decarb à 100 millimolaire sur des boîtes de Pétri non ventilées de 60 millimètres contenant 7,5 millilitres de milieu. Laissez sécher les plaques d'Al Decarb pendant environ 30 à 60 minutes à température ambiante.

Il n'est pas nécessaire de fendre les couvercles après le séchage des boîtes. Ajouter des volumes constants d’E. coli au centre de chaque boîte Alde Carb et laisser sécher encore 30 à 60 minutes. À température ambiante, nous ajoutons généralement 25 microlitres d’E. coli OP50.

Ce volume d'OP 50 crée une pelouse bactérienne suffisamment étendue pour maintenir les vers dans une petite zone au centre de la boîte sans surpeuplement. Une fois la pelouse bactérienne sèche, procéder aux tests alba carb. En raison du caractère subjectif des tests ALD carb, il est fortement recommandé d'effectuer les expériences en aveugle.

Pour ce faire, un collègue du chercheur principal doit reétiqueter les plaques d'origine contenant les vers à analyser, ou bien le collègue peut transférer les vers des plaques d'origine vers des plaques cipher alde carb juste avant de démarrer un chronomètre. Maintenant que les plaques ont été sied boron ABO, l'analyse peut commencer en comptant le nombre de vers paralysés.

Il existe deux approches principales pour définir la paralysie aiguë induite par le décarboxyle. La première approche définit la paralysie par l'arrêt du pompage pharyngé. Dans cette note vidéo, une structure sombre située dans la lumière du pharynx du ver, à droite de l'écran.

Cette structure est appelée broyeur et se contracte de manière rythmique grâce à un mécanisme cholinergique. La locomotion du ver dans cette vidéo a été fortement ralentie par une exposition à l'Al Decarb. Toutefois, le broyeur pharyngé de ce ver continue de bouger visiblement.

Par conséquent, ce ver n'est pas paralysé selon la définition basée sur l'arrêt du pompage. On doit observer sur cette vidéo que le broyeur pharyngé, situé à droite de l'écran, ne se contracte pas en l'absence de pompage, ce qui correspond à la définition opérationnelle de la paralysie induite par al Decarb. Ce ver doit être noté comme paralysé.

Cependant, comme le ver dans la vidéo précédente, ce ver effectue de légers mouvements de recherche de côté à côté. Bien que sa locomotion soit altérée par l'Al Decarb, ces mouvements empêcheraient un expérimentateur de considérer ce ver comme paralysé selon la deuxième approche de définition de la paralysie induite par l'Al Decarb, à savoir l'immobilité complète du corps et l'absence de réponse au toucher. La deuxième approche pour définir la paralysie induite par l'Al Decarb consiste à piquer systématiquement chaque ver avec un fil de platine et à vérifier s'il y a une réponse.

Si les mouvements du corps ne peuvent pas être détectés à l'œil nu, notre approche privilégiée consiste à piquer deux fois la tête et deux fois la queue de nos vers toutes les 30 minutes, pendant une durée totale de trois heures. Comme vous pouvez le constater, le ver dans cette vidéo ne déplace pas visiblement son corps. Néanmoins, comme ce ver réagit aux piqûres en déplaçant clairement sa queue, nous ne considérons pas ce ver comme paralysé.

Selon la deuxième définition de la paralysie induite par l'al décab. Comme le ver dans la vidéo précédente, ce ver ne déplace pas visiblement son corps et nécessite donc un test de piquage. Cependant, contrairement au ver de la vidéo précédente, ce ver ne répond pas clairement au piquage.

Par conséquent, ce ver est paralysé selon la deuxième définition de la paralysie induite par al decarb. Bien que la différence entre un ver paralysé et un ver non paralysé par l'alde carb puisse être subtile, les expérimentateurs devraient être en mesure d'identifier des altérations importantes et la transmission synaptique en observant simplement un grand nombre de vers représentatifs exposés à Al Decarb immédiatement après avoir été transférés sur des boîtes contenant Al Decarb. Les vers de type sauvage restent mobiles.

Dans cette vidéo, on observera les mêmes vers de type sauvage de la vidéo précédente, après une heure d'exposition au décarburation à l'Al. Notez que les vers ralentissent dans une certaine mesure, mais qu'ils bougent encore clairement.

Contrairement aux vers de type sauvage, les mutants tomasin un de cette vidéo sont soit complètement immobilisés, soit à peine mobiles après une heure d'exposition. Ce résultat est cohérent avec le fait que les mutants tomasin un présentent une sécrétion excessive d'acétylcholine due à une incapacité à réguler négativement la libération de neurotransmetteurs au niveau des jonctions neuromusculaires, l'excès d'acétylcholine dans les fentes synaptiques aux jonctions neuromusculaires combiné à l'inhibition de la dégradation de l'acétylcholine rendant les mutants tomasin un hypersensibles. Bien que cela ne soit pas montré ici, des résultats similaires ont été postulés à partir de tests au bial décab, ainsi que d'essais au alde carb avec des allèles perte de fonction de on 43, qui code l'orthologue C. elegans de la protéine kinase dépendante du calcium calmoduline deux. Cette vidéo montre des mutants on 25, qui sont déficients en transmission GABAergique inhibitrice.

Après une heure d'exposition à l'aldecarb, à l'instar des mutants tomasin un et M 43, ces mutants présentent des troubles importants de la locomotion induits par l'aldecarb et semblent plus affectés que les vers de type sauvage exposés à l'aldecarb pendant une durée identique. Ce résultat est compatible avec une surstimulation des muscles de la paroi corporelle chez les mutants M 25, résultant d'une combinaison de l'exposition à l'aldecarb et d'une transmission GABAergique réduite, conduisant à un rapport plus élevé entre transmission excitatrice et inhibitrice au niveau des jonctions neuromusculaires des CL ELs, et à une paralysie ultérieure. Toutefois, comme les mutants tomasin un sur 43 et sur 25 présentent des sensibilités similaires à l'aldecarb à ce point temporel.

Bien que les causes de la surstimulation des muscles de la paroi corporelle soient différentes, un expérimentateur ne pourrait pas connaître le mécanisme sous-jacent de l'hypersensibilité sans d'abord identifier les mutations responsables. Pour cette vidéo, nous sommes revenus aux mêmes vers sauvages d'une vidéo précédente après trois heures d'exposition à l'al Decarb ; à ce stade final de notre test ALD carb, on doit clairement observer que ces vers, bien qu'ils soient de type sauvage, sont soit complètement immobilisés, soit à peine mobiles. Ces vers sont désormais phénotypiquement similaires aux mutants TOM un et M 25 observés une heure après l'exposition à l'alde carb, probablement parce que la transmission cholinergique excitatrice a atteint des niveaux comparables. En revanche, les mutants Synap Bren un restent nettement mobiles après trois heures d'exposition à l'alde carb.

Ce résultat est conforme à celui observé chez les mutants Synaptive Bren un, qui présentent des niveaux anormalement bas de sécrétion de neurotransmetteurs et subissent une stimulation cholinergique moindre au niveau de leurs muscles pariétaux par rapport aux vers de type sauvage, après une exposition identique à l'aldecarbe à ce stade. Les mutants Point sur quatre, qui sont spécifiquement déficients en transmission cholinergique, devraient présenter une sensibilité similaire à l'Aldecarbe à celle des mutants Synaptive Bren un. En revanche, les mutants hypersensibles Tomasin un et O 25 restent paralysés, tout comme les vers de type sauvage.

Il convient de noter que certains vers, en particulier ceux qui sont résistants à l'Al Decarb, peuvent tenter de ramper hors de la boîte. Dans ce cas, l'expérimentateur peut appliquer une quantité constante d'acide palmitique, qui constitue une barrière physique au déplacement des vers. Autour des boîtes Al Decarb, nous appliquons 25 microlitres de 10 milligrammes d'acide palmitique par millilitre d'éthanol.

Cela termine le protocole d'exposition à l'Al Decarb. Maintenant, je vais démontrer le protocole d'exposition à la Penta Lean Terazol. Kaylin Berry nous aidera pour les tests au PTZ.

La préparation des vers pour les tests au PTZ est essentiellement la même que celle utilisée pour les tests au aldecarbe. Les seules différences notables entre ces deux tests sont les suivantes. Nous utilisons de l’eau désionisée comme solvant pour le PTZ, au lieu de l’éthanol à 70 %.

De plus, comme nous ensemens fréquemment des volumes plus importants de PTZ que de ALDE carb, nous laissons les boîtes sécher pendant au moins une heure avant d'ajouter l'OP 50. L'acide palmitique peut également être utilisé avec le PTZ. Par ailleurs, il est important de noter que le PTZ est nettement moins stable que l'alde carb et doit être conservé à moins 20 degrés Celsius.

Pour commencer l'analyse, compter le nombre de vers épileptiques en convulsions sous la lumière toutes les 30 minutes pendant une durée totale d'une heure. Il est préférable de classer le nombre de vers présentant différents types de convulsions en catégories distinctes, telles que les convulsions généralisées, les convulsions antérieures, que nous appelons « head Bobs », la combinaison de convulsions antérieures avec une paralysie des muscles de la paroi corporelle, que nous appelons tonico-clonique, ou la paralysie généralisée, que nous appelons tonique tonique. Une activité semblable à une crise, comme celle observée avec le ver à droite, suit souvent des convulsions tonico-cloniques, telles que celles observées avec le ver à gauche tonique.

L'activité semblable à une crise pourrait simplement résulter d'une fatigue musculaire après des convulsions tonico-cloniques répétées. Toutefois, nos données non publiées indiquent que certains vers peuvent devenir toniques en présence de PTZ d'une manière similaire à la paralysie induite par al decarb, sans avoir préalablement présenté de phase tonico-clonique. Nous montrons ici un ver mutant pour la transmission synaptique représentatif, en train de ramper en l'absence de PTZ, un antagoniste des récepteurs GABA et un inducteur courant de crises dans divers modèles animaux d'épilepsie et de crises.

Remarquez que l'extrémité ou la pointe du ver oscille d'un côté à l'autre pendant qu'il cherche de la nourriture. Dans cette vidéo, nous présentons un autre ver de la même souche mutante de transmission synaptique utilisée dans la vidéo précédente. Observez que ce ver, placé en présence de 2,5 milligrammes de PTZ par millilitre d'eau, continue principalement à déplacer sa tête de côté à côté tout en cherchant de la nourriture.

Pourtant, ce ver interrompt occasionnellement son exploration latérale et projette plutôt de façon répétée son extrémité antérieure vers l'avant. Enfin, on devrait observer un ver portant la même mutation que les vers des deux vidéos précédentes, en présence de 10 milligrammes de PTZ par millilitre d'eau. On remarque que ce ver présente une exploration latérale réduite et projette son extrémité antérieure vers l'avant avec une fréquence et une intensité plus grandes qu'avec la concentration inférieure de PTZ.

Ces résultats démontrent la dépendance à la dose de la PTZ, que nous observons chez tous les mutants de la transmission synaptique sensibles à la PTZ. Il est important de noter que l'exposition à la PTZ ne suffit pas à induire des convulsions de type épileptique chez les vers de type sauvage. De même, nous avons tenté, sans succès, d'observer des convulsions de type épileptique induites par la PTZ chez des vers présentant des déficits spécifiques de la transmission cholinergique, comme les mutants *on four*, ou chez des vers présentant une transmission cholinergique excessive, comme les mutants *tomasin one*.

Par conséquent, il devrait être possible de caractériser davantage les mutants de la transmission synaptique présentant une résistance à l'aldecarbe, soit par des déficits de la fonction synaptique générale, soit par des déficits spécifiques de la transmission cholinergique, en fonction de leur sensibilité relative au PTZ. Peut-être de manière surprenante, un mutant ONC 25 présentant une forte réduction de fonction, qui ne montre aucune expression détectable de GABA dans les neurones moteurs inhibiteurs de C. elegans, n'présente pas de convulsions épileptiques spontanées telles qu'observées dans cette vidéo.

Un mutant ONC 25 sur 10 milligrammes de PTZ par millilitre d'eau. Toutefois, il présente des convulsions tonico-cloniques robustes, bien que des convulsions antérieures isolées avec certains mouvements précèdent parfois les convulsions tonico-cloniques associées à ONC 25 et imitent les convulsions observées chez les mutants synap Bren un. Par conséquent, un expérimentateur ne devrait pas supposer que tous les mutants GABA inhibiteurs présenteront des convulsions tonico-cloniques ou une activité épileptique tonique étroitement associée en présence de PTZ, particulièrement compte tenu de la probabilité d'obtenir des allèles mutants hypomorphes.

Maintenant que nous avons démontré une hypersensibilité à l’alde carb et au PTZ chez les mutants GABA inhibiteurs, mais uniquement une hypersensibilité à l’alde carb et une sensibilité normale au PTZ chez les mutants dépourvus de régulation négative de la transmission cholinergique, on pourrait se demander à quoi ressemblent les mutants déficients pour UNC 43 en présence de PTZ, puisqu’ils sont également hypersensibles à l’alde carb, comme nos autres mutants de la transmission synaptique. Les mutants 43 n’affichent pas de convulsions épileptiformes évidentes en l’absence de PTZ, bien qu’ils présentent de rares contractions spontanées du corps entier, non répétitives. Toutefois, après exposition à 10 milligrammes de PTZ par millilitre d’eau, les mutants 43 déficients présentent des convulsions généralisées robustes, répétitives et dépendantes de la dose. À ce stade, ces résultats restent ambigus, mais semblent indiquer qu’UNC 43 ne joue pas un rôle spécifique dans la transmission GABAergique inhibitrice, ou qu’il n’intervient que dans la régulation négative de la libération du neurotransmetteur.

Dans le système nerveux de C. elegans, nous venons de vous montrer comment caractériser les mutants de la transmission synaptique CL elegans à l'aide de stimulants neuronaux complémentaires : l'aldecarbe, un inhibiteur de la cholinestérase, et le PTZ, un antagoniste des récepteurs GABA. Lorsqu'on suit un paradigme pharmacologique complémentaire, gardez à l'esprit que le degré de sensibilité à un stimulant neuronal ne permet pas de prédire le degré de sensibilité à un autre stimulant neuronal. L'utilisation de tests à l'aldecarbe devrait permettre de distinguer les mutants GABA inhibiteurs, qui effectuent un mouvement de hochement de tête (head bob) en présence de PTZ mais sont hypersensibles à l'aldecarbe, des mutants présentant un déficit général de la fonction synaptique, qui effectuent également un hochement de tête en présence de PTZ mais sont résistants à l'aldecarbe. En outre, on doit noter que les mutants GABA inhibiteurs effectuent un hochement de tête en présence de PTZ, tandis que les vers dépourvus de régulation négative de la transmission cholinergique apparaissent de type sauvage en présence de PTZ.

Par conséquent, le test au PTZ pourrait également être utilisé pour distinguer entre ces classes de mutants de la transmission synaptique, qui sont tous deux hypersensibles à l'Alde carb. En résumé, une approche complémentaire utilisant les tests au PTZ et à l'Alde carb devrait permettre à un expérimentateur de caractériser les mutants de la transmission synaptique chez C. elegans d'une manière impossible avec l'un seul de ces deux médicaments. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.