Évitement osmotique Caenorhabditis elegans: La fonction synaptique de deux gènes, orthologues de l'homme NRXN1 Et NLGN1, Comme candidats pour l'autisme

Bonjour, je m'appelle Manuel Ruiz Rubio, du Département de génétique de l'Université de Cordoue en Espagne. Nous utilisons l'élégance comme outil expérimental dans l'étude de l'autisme, en tirant parti du système nerveux entièrement caractérisé de C. elegans. Nous étudions des mutants du nématode, déficients dans des gènes impliqués dans la synapse neuronale et associés à l'autisme.

Les régulines sont des molécules d'adhésion membranaires présentes dans la synapse. La tête de C. elegans contient l'amphidie, un organe sensoriel du nématode qui médie les réponses à différents stimuli, notamment la force osmotique. L'amphidie est composée de 12 neurones sensoriels bipolaires munis de dendrites ciliées et d'un axone terminal présynaptique.

Deux de ces neurones, nommés ASHR et ASHL, sont particulièrement importants dans la fonction sensorielle osmotique, détectant les répulsifs hydrosolubles ayant une forte intensité osmotique. Nous décrivons ici une méthode basée sur un anneau de fructose pour mesurer l'évitement osmotique chez des mutants de C. elegans présentant des défauts synaptiques.

Pour évaluer les implications des neuroligines et des neurexines dans l'évitement de la forte force osmotique, nous avons rapporté la réponse différente de mutants de C. elegans déficients pour les gènes nrx-1 et nlg-1, en utilisant une méthode basée sur une solution de fructose à quatre molar. Le jour de l'expérience, préparer une solution mère de fructose à quatre molar contenant 1 % de rouge Congo et bien la dissoudre à température ambiante. Tracer un anneau de un centimètre de diamètre sur une plaque NGM en le délimitant légèrement au centre du milieu solide.

En utilisant 15 microlitres de la solution rouge de fructose quatre molaire. Laisser le fructose pénétrer dans l'agar pendant environ cinq minutes. L'expérience doit être réalisée en aveugle. La boîte contenant chaque souche à tester doit être étiquetée par un deuxième expérimentateur.

Le SA est effectué en utilisant ces marques qui sont non sollicitées. Lorsque l'expérience est terminée, environ 24 heures avant la réalisation de la vente, il est nécessaire de prélever quatre larves de chaque génotype et de les transférer sur une plaque AFL NGM contenant des bactéries e coli, puis de les maintenir à 20 degrés Celsius jusqu'au lendemain. L'expérience doit être commencée avec des adultes jeunes.

Placer un ver individuel de chaque souche dans le cercle de repos et suivre chaque animal jusqu'à ce qu'il réagisse à la barrière en forme de tic. Dix animaux de chaque souche et un minimum de trois expériences répétées doivent être réalisés pour obtenir un résultat concluant. Ceux qui évitent l'anneau rouge six fois de suite sont classés comme normaux.

Ceux qui sortent de l'anneau en moins de six tentatives sont considérés comme déficients en contrôle de la sensibilité à l'osmose ; une souche témoin doit être utilisée à chaque fois, ainsi que deux animaux servant de contrôles positifs car ils évitent l'obstacle de l'anneau. Les souches témoins réagissent en reculant lorsqu'elles rencontrent une barrière osmotique constituée de fructose à quatre molaire. Les mutants déficients pour les neuroligines présentent un comportement similaire à celui-ci vis-à-vis de la force osmotique.

Cependant, les mutants déficients en NEUR n'ont pas réussi à détecter cette barrière osmotique. Les doubles mutants aux allèles différents de neur et nout ont retrouvé le phénotype sauvage, répondant à la force osmotique pour obtenir des vers en bas par l'interférence ARN via l'alimentation. Isoler des colonies de E. coli souche HD 11,5 qui a été transformée avec le vecteur L 44 40 contenant un fragment correspondant au gène cible. Les bactéries sont isolées sur boîte de LBA ou de gélose au carbonate le lendemain.

Prélevez une colonie de bactéries et inoculez un milieu liquide LV. Incubez environ sept heures avec agitation à 37 degrés. Déposez une goutte de cette culture sur une boîte de milieu NGM contenant du céramique carbonique et de l'IPTG, puis laissez reposer toute la nuit à température ambiante, afin de permettre la croissance bactérienne et l'induction de l'expression du fragment du gène cible.

Il est nécessaire d'utiliser un contrôle positif et un contrôle non négatif pour l'interférence ARN. Expériences d'alimentation. Le contrôle négatif est identique.

I HT 11 cinq souches transformées avec le vecteur TL 44 40. Les témoins positifs ELI HT 11 cinq cellules transformées avec le vecteur L 44 40 contenant une séquence du gène 22. L'extinction de ce gène provoque un phénotype de tremblement facilement distinguable au microscope stérile.

Premier jour. Quatre larves au stade L4 provenant de boîtes de culture NGM PLA contenant des bactéries sont transférées sur une boîte contenant des bactéries et du Koweït, à 20 degrés Celsius pendant 12 heures. Cette période constitue un jeûne.

Le lendemain, transférez un jeune adulte rapide sur une boîte de culture ensemencée avec des bactéries exprimant le gène cible d'interférence ARN spécifique. Incubez environ 48 heures à 20 degrés Celsius pour obtenir la descendance F1. Ensuite, sélectionnez quelques bombes adultes F1 et placez-les sur une autre boîte de culture ensemencée avec les mêmes bactéries au cours des deux jours suivants.

Sélectionner et isoler des jeunes adultes parmi la descendance F2 en évaluant les phénotypes de la souche sauvage Bristol N2 grasse avec des bactéries présentant une empathie. Le vecteur L 44 40 reculait lorsqu'il était fin. La barrière osmotique.

La souche de type blanc vrai de Bristol nourrie avec des bactéries exprimant un fragment du gène neur de l'élégance n'a pas réussi à détecter les solutions osmotiques. Cependant, le mutant déficient en neur, incapable de détecter la barrière osmotique, a recouvré cette capacité lorsqu'il a été nourri avec des bactéries exprimant un fragment du gène nane de C. elegans. Dans cette vidéo, nous présentons une méthode simple permettant d'étudier l'effet des gènes affectant la réponse d'évitement osmotique chez C. elegans.

Un anneau de fructose formé de manière serrée avec du rouge Congo est utilisé pour analyser la réponse du ver à la force osmotique. Les mutants déficients en neuroligine présentent un défaut dans cette réponse ; toutefois, les mutants NU ne sont pas altérés dans la détection du stress osmotique, montrant une réponse similaire à celle de la souche sauvage. Cette vidéo montre que les souches doubles mutantes portant différents allèles nuls dans les gènes impliqués dans l'interaction et la libération retrouvent le phénotype sauvage en répondant à la force osmotique.

Ces observations ont été confirmées à l'aide de l'interférence ARN, en utilisant une approche de blocage par alimentation. De cette manière, la souche sauvage présentait un défaut de reconnaissance de la barrière osmotique lorsqu'elle était nourrie avec des bactéries exprimant la séquence correspondante du gène ING. En revanche, les mutants déficients neur, incapables de détecter la solution de fructose à forte concentration, ont retrouvé ce comportement lorsqu'ils ont été nourris avec des bactéries exprimant la séquence correspondante du gène NNU.

Les résultats présentés dans cette expérience indiquent que nrx-1 et nlg-1 pourraient être impliqués dans la connexion synaptique des neurones sensoriels du nématode, et aussi qu'ils interagissent l'un avec l'autre d'une manière qui affecte la fonction synaptique. Bonne fin de journée et bonne chance avec vos expériences.