Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

Les pipettes capillaires en verre sont devenues omniprésentes dans les laboratoires pour une grande variété de techniques, telles que l'électroporation de cellule unique, la microinjection d'ADN et l'électrophysiologie en configuration de patch. Pour préparer des électrodes en verre capillaire pour des enregistrements en configuration de patch, on tire du verre silicaté sur un tireur programmable. Les extrémités des électrodes sont enduites de cire, puis polies à la flamme et stockées pour une utilisation ultérieure. Bonjour, je suis Miriam Goodman du Département de physiologie moléculaire et cellulaire de l'Université Stanford.

Dans cette vidéo, je vais montrer comment fabriquer des pipettes pour la technique du patch clamp et des électrodes pointues destinées à l'électrophysiologie. Les microélectrodes en verre, également appelées pipettes, sont un outil fondamental de l'électrophysiologie depuis des décennies. Aujourd'hui, ces pipettes sont réalisées à partir de capillaires en verre à l'aide d'un tireur programmable.

Commençons donc. Pour fabriquer des pipettes de patch clamp, nous utilisons des capillaires en verre borosilicate Sutter exempts de poussière et propres, ainsi qu’un tireur d’électrodes à flamme Sutter P-97. Le Pipette Cookbook de Sutter constitue une référence excellente pour élaborer des programmes de tirage adaptés.

Pour commencer, soulevez le couvercle anti-poussière du tireur. Ensuite, prenez un tube capillaire en verre dans la boîte. Veillez à remettre le couvercle afin de minimiser l'accumulation de poussière.

Ensuite, à l’aide d’une main, faites glisser le capillaire dans la rainure située d’un côté du filament, puis serrez légèrement la pince. À ce stade, la pince doit être suffisamment serrée pour empêcher le tube de tomber, mais assez lâche pour permettre de le faire glisser dans la rainure. Relâchez maintenant le frein en métal à ressort du même côté.

Ensuite, saisissez avec le pouce et l'index les languettes métalliques fixées à la base des deux supports. Relâchez l'autre butée en métal ressort. Rapprochez les supports au maximum et maintenez-les en place d'une main.

Ensuite, faites glisser le tube à travers le logement du filament jusqu'à la rainure du support situé de l'autre côté. Évitez de pousser le verre contre le filament chauffant. Serrez les pinces des deux côtés.

Ils doivent être suffisamment serrés pour maintenir les supports en place, mais pas trop au point de briser le verre. Fermez maintenant le couvercle anti-poussière et appuyez sur le bouton vert. Les micropipettes à pôle marqué destinées aux enregistrements en configuration patch sont fabriquées à l’aide d’un programme de tirage en cinq étapes, avec une chaleur et une vitesse décroissantes à chaque étape, et un petit pôle lors de la dernière étape.

Ce programme utilise la chaleur et la gravité. La procédure de fabrication des électrodes pointues est très similaire, mais dans ce cas, nous utilisons la capillarité en verre fine de Warner Instruments, dont le diamètre extérieur est de un millimètre et le diamètre intérieur de 0,78 millimètre. Nous appliquons également un programme d'étirage qui utilise un moteur en plus de la chaleur et de la gravité lorsque les programmes d'étirage sont terminés.

Soulevez le couvercle anti-poussière, desserrez les deux pinces et retirez la pipette terminée. Ensuite, placez les pipettes dans une boîte de travail. Cette boîte peut être fabriquée en collant une bande de mousse sur le support d'une boîte en plastique pour embouts de pipette, puis en découpant six à huit fentes dans la mousse.

Insérez les pipettes dans les fentes. Une fois la boîte remplie de pipettes étirées, passez à l'étape de polissage au feu pour polir les pipettes à la flamme. Installez un dispositif de micro-four équipé d'un filament chauffant en platine commandé par une pédale avant de commencer le polissage au feu.

Tout d'abord, recouvrez la pipette de cire dentaire afin de réduire la capacité et d'améliorer les caractéristiques de bruit. Pour ce faire, tenez à portée de main une petite quantité de cire fondue. Appliquez une pression d'air à l'arrière de la pipette pour empêcher la cire d'entrer dans l'embout.

Plongez ensuite brièvement la pointe dans la cire liquide. Et retirez-la maintenant. Placez la pipette dans l'appareil de polissage et approchez la pointe à environ 50 microns du filament.

Gardez à l'esprit que le filament va se dilater lorsqu'il sera chauffé. Appliquez une courte impulsion de chaleur d'une ou deux secondes pour éliminer la cire de l'extrémité de la pipette et lisser le verre. Examinez les extrémités des pipettes au microscope afin de déterminer le diamètre de l'ouverture et la régularité de la surface.

Pour les enregistrements standards en configuration « patch clamp », les ouvertures des pointes doivent avoir un diamètre compris entre un et trois micromètres ; jetez les pointes rugueuses, irrégulières ou mal formées. Placez la micropipette terminée dans une boîte de travail, en veillant à bien fermer le couvercle afin de protéger les micropipettes de la poussière. Répétez l'opération jusqu'à l'obtention de 10 micropipettes réussies. Je viens de vous montrer comment fabriquer des micropipettes pour l'enregistrement « patch clamp » et des électrodes pointues à l'aide d'un tireur programmable.

La même procédure peut être utilisée pour fabriquer une variété d'outils en verre, notamment des aiguilles d'injection pour obtenir des résultats optimaux en enregistrement en mode patch clamp. Il est important de se rappeler de tirer de nouvelles pipettes exemptes de poussière le jour même de l'expérience et de les polir moins d'une heure avant l'expérience. Vérifiez également par inspection que les pipettes sont lisses et bien polies.

Assurez-vous de regarder notre autre vidéo, qui montre comment effectuer un enregistrement en configuration patch clamp des canaux ioniques exprimés dans des ovocytes d'opus. Voilà, c'est terminé. Vous êtes désormais un expert en pipettes, et bonne chance avec vos expériences.