ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

נוהל זה מתחיל בהשגת ביומסה מיקרוביאלית ימית מדגימות מים על ידי סינון מקדים דרך מסננים של 5 ו-3 מיקרומטר, ולאחריו איסוף על מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן מופק total RNA מהאורגניזמים שנלכדו על מסנן ה-0.22 מיקרומטר. ה-rRNA מוסר מה-total RNA באמצעות דגרדציה אנזימטית סלקטיבית והיברידיזציה סובטרקטיבית, ו-Mr.N מועשר ומוגבר ליניארית באמצעות polyA tailing ותעתוק in vitro.

ה-RNA נוגד-הsense המוגבר מומר לאחר מכן ל-CD NA דו-גדילי באמצעות random hexamer. ניתן לשבט ולרצף את ה-CD NA שהתקבל, או לבצע עבורו pyro sequencing באופן ישיר. שלום, אני רייצ'ל פרסקי מהמעבדה של ד"ר מריאן מוראן במחלקה למדעי הימים של אוניברסיטת ג'ורג'יה.

היום נדגים לכם פרוצדורה לבחינת ביטוי גנים מדגימות סביבתיות, באמצעות מטא-טרנסקריפטומיקה סביבתית. סקוט גיפורד יראה לכם כיצד לעבד דגימות סביבתיות לצורך איסוף RNA.

אראה לכם כיצד להפיק RNA מהדגימות ולבצע בדיקות RIN. AON תדגים את הסרת ה-RNA. לאחר מכן, מאריה קוסטה תעבור על שלבי הגברת ה-RNA וסינתזת cDNA.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל באיסוף ה-RNA הסביבתי, נכין את מערכת קו הסינון על ידי הנחת קצה אחד של הצינור במים בעומק הדגימה הרצוי, ונחבר את הקצה השני למסנן 3 µm לנפח גבוה, כאשר המשאבה ממוקמת בין שני קצות הצינור. לאחר מכן, מסנן ה-3 µm מחובר למגדל סינונים של 0.22 µm, והזרימה מופנית ממגדל ה-0.22 µm אל תוך כלי מידה מדורג.

העבירו מספר ליטרים של מים דרך המערכת לשטיפה. בסיום, הוציאו את הצינור מהמים בזמן שהמשאבה פועלת כדי לנקות את המים שנותרו בקו. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח מסנן 0.22 micrometer על מגדל הסינון וסגרו אותו.

החזירו את קצה הצינור אל תוך המים והפעילו את המשאבה. המתינו עד שהאוויר ינוקה משני המסננים ועקבו אחר נפח המים המסוננים באמצעות המד שעל המכל. לאחר שסונן הנפח הרצוי, הוציאו את הצינור מהמים ונקו את שארית המים מהמערכת.

ברגע שהמסנן יבש, הסירו במהירות את פלטת המסננים העליונה וקפלו את נייר המסנן. הכניסו את המסנן לתוך whirl pack והקפיאו אותו באופן מיידי בחנקן נוזלי. לפני תחילת הניסוי, חשוב לציין כי מכיוון ש-RNAs נמצאים בכל מקום ו-mRNAs מתפרקים במהירות, יש להקפיד על אמצעי הזהירות הסטנדרטיים לעבודה בסביבה נקייה מריבונוקלאז, כולל משטחי העבודה והפיפטים.

Bearing this in mind, יש להשתמש בכפפות נקיות בעת טיפול בכל החומרים המשמשים בפרוצדורה זו. כמו כן, יש לעבד את הדגימות בזמן קצר ככל האפשר. כדי להתחיל את מיצוי ה-RNA הכולל מהמסנן בעל נקבים של 0.22 µm, נכין מבחנות עם פנינים על ידי הוספת 8 mL של RLT buffer עם beta mercaptoethanol למבחנה קונית של 50 mL.

לאחר מכן מוסיפים 1 עד 2 מיליליטר של חרוזי RNA מערכת הפקת קרקע של mobile power. מוציאים במהירות את המסנן הקפוא מהמקפיא ושומרים אותו בתוך ה-world pack. מנפצים אותו בעזרת פטיש.

הוסיפו את המסנן המרוסק למבחנה קונית של 50 milliliter שהוכנה מראש, ואטמו את מכסה המבחנה בעזרת Parafilm או סרט דביק למעבדה; ערבבו ב-vortex למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובבו את המבחנה של 50 milliliter בצנטריפוגה במהירות של 5, 000 RPM למשך דקה אחת. בטמפרטורת החדר, הסירו כמה שיותר מהליזאט (lysate) והעבירו אותו למבחנה של 15 milliliter לפני סבב צנטריפוגה נוסף של חמש דקות.

ב-5,000 ×g, העבירו את העילאי לנבובת חדשה של 50 מיליליטר והוסיפו לנפיח הליסאט נפח אחד של 100% ethanol. בעזרת מזרק של 10 מיליליטר, שאבו את הליסאט דרך מחט בכיול 18 עד 21 gauge והחזירו אותו חמיש פעמים בערך. בשלבי המיצוי הבאים, השתמשו בערכה KaiGen R and easy mini בהתאם להוראות היצרן, תוך העברת הליסאט לעמודה המסופקת באמצעות סעפת ואקום או באמצעות צנטריפוגה חוזרת.

כמת את ה-RNA הכולל באופן ספקטרופוטומטרי. לאחר קביעת תנובת ה-RNA הכוללת, נשתמש בערכת Ambien turbo DNA free בהתאם להוראות היצרן כדי להסיר זיהומים של DNA. כעת, כאשר מיצוי ה-RNA הושלם, אמסור את ה-RNA הכולל ליוחנה, שתבצע את השלבים הראשון והשני של הסרת RRNA.

תודה רחל. כדי להתחיל את הסרת ה-RRNA, ערבבבי בעדינות וצנטריפוגי קצרות את תמיסת התגובה בריכוז 10x לפני השימוש. בתוך מבחנה סטרילית ללא RNA בנפח 0.5 מיליליטר, ערבבי את הנפחים המתאימים של תמיסת תגובה בריכוז 10x, מעכב RNA, דגימת RNA כולל ו-terminator exonuclease. בהתאם לפרוטוקול של epicenter, דגרי את התגובה בטמפרטורה של 30 °C למשך 60 דקות בטרמוסייקלר עם מכסה מחומם או במקלח מים.

בשלב הבא, סיימו את התגובה באמצעות שיקוע פנול-אתנול על ידי הוספת מים נקיים ל-RNA עד לנפח כולל של 200 microliters, ולאחר מכן הוספת נפח אחד של תמיסת פנול-כלורופורם ביחס של 1:1 ל-mRNA בצנטריפוגה. אספו את הפאזה המימית ובצעו שיקוע באמצעות 100% ethanol ומלח. זוהי נקודה אפשרית לעצירה.

ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בדגימה ביישומים המשכיים. לאחר השלמת העשרה ראשונה של mRNA, נשתמש בערכות Ambien microbe enrich ו-microbe express בהתאם להוראות היצרן כדי להסיר שאריות של rRNA מהדגימה שלנו. כדי להקל על הסרת rRNA אוקריוטי, נשתמש בערכת microbe enrich.

כל הנפחים נקבעים על פי הוראות היצרן. לתחילת העבודה, פפטר 300 microliters של תמיסת קישור (binding buffer) לשפופרת של 1.5 milliliter. הוסף 5 עד 100 micrograms של RNA כולל בנפח מקסימלי של 30 microliters וערבב באמצעות וורטקס.

הוסיפו בעדינות 2 µL של תערובת capture oligo עבור 5 µg RNA לתוך binding buffer והקישו בעדינות על המבחנה. סובבו את התערובת קצרות בצנטריפוגה (spin down). דנטורו את התערובת בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות, לפני דגירה של התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

במהלך דגירה זו, הכין את חרוזי המגנט (oligo mag beads) על ידי שטיפתם פעם אחת במים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) ופעם אחת בבופר קישור (binding buffer), תוך כדי לכידת החרוזים על מעמד מגנטי בין השטיפות. שמור את החרוזים על קרח והבא אותם לטמפרטורת החדר. חמש דקות לפני השימוש, חמם את תמיסת השטיפה ל-37 °C בבלוק חימום.

הוסיפו את תערובת anoligos של לכידת RNA לחרוזי המגנט עם ה-oligo שנשטפו, ערבבו בעדינות את המבחנה וסובבו אותה בצנטריפוגה. דגרו את התערובת בקיצור בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. הניחו את המבחנה במעמד המגנטי והמתינו כသုံး דקות לפני שאיבת הנוזל העליון המכיל mRNA והעברתו למבחנה איסוף על קרח.

בשלב הבא, הוסף 100 µL של תמיסת שטיפה שחוממה מראש לחרוזי הלכידה. ערבב בעדינות באמצעות וורטקס (vortex) והוצא את הנוזל העליון (supernatant). העבר את הנוזל העליון המכיל mRNA למבחנה האיסוף על קרח.

הניחו מבחנה לאיסוף על קרח בזמן ההכנה להסרת RRNA פרוקריוטי באמצעות ערכת ambi microbe express, אותה נשתמש כדי להסיר RRNA פרוקריוטי ששאר. השתמשו ב-bioanalyzer או ב-Experion כדי לבדוק זיהום של RRNA ואת איכות ה-MR.NA. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.

ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר הסרת ה-RRNA, נשתמש בערכה Ambien message AMP two bacteria בהתאם להוראות היצרן כדי להגביר את ה-mRNA שלנו. כעת, לאחר שיש בידינו דגימה טהורה של mRNA, אעביר את הניסוי למריה, שתדריך אתכם בתהליכי הגברת ה-mRNA וסינתזת CDNA.

תודה לך, האנה. לפני שנתחיל בהגברת ה-mRNA, חשבי את הנפחים של כל רכיב בתערובות המאסטר של ערכת Ambien message AMP two bacteria באופן מקוון. נתחיל בפוליאדנילציה של RNA התבנית על ידי העברת עד 1000 nanograms של RNA כולל למבחנה מיקרוצנטריפוגית סטרילית ללא RNA. השתמשי ב-6.5 microliters של דגימה ובלי מים ללא RNA בבופר הראשון כדי לסנתז RNA באמצעות תעתוק במבחנה (in vitro transcription).

מומלץ להשתמש בתנור היברידיזציה או באינקובטור בשל הטמפרטורה האחידה שלהם. ומכיוון שחשוב ביותר למנוע היווצרות עיבוי בתוך המבחנות, אנו ממליצים בחום על דגירה של תגובת שעתוק in vitro למשך 14 שעות. כדי למקסם את תנובת ה-RNA עבור תנובת A RNA הגבוהה ביותר, בצעו את ה-IBT בנפח תגובה סופי של 40 µL ואחסנו את ה-A RNA בטמפרטורה של 80°C- במקבצים של כ-10 µL.

לאחר הגברת ה-RNA, הגיע הזמן לסנתז את ה-CDNA המשלימי. ערכת ה-Promega universal ribot Clone CDNA synthesis system משמשת לסנתז CDNA מה-RNA. הערכה מספקת הנחיות להמרת שני מיקרוגרם RNA ל-CDNA. אנו ממליצים על כמות התחלה של 6 עד 10 מיקרוגרם RNA והתאמה של התגובות בהתאם.

יש לנקות את ה-CD NA באמצעות שקיעה באתנול או באמצעות מערכת ה-promega wizard DNA cleanup. בהתאם להוראות היצרן, יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C. בנקודה זו ניתן לבצע ריצוף ישיר של cDNA דו-גלי. מתוך 10 liters של מי ים, חילצנו כ-10 micrograms של RNA סביבתי והגברנו אותו פי 20; באמצעות המרה של ה-MR.NA המוגבר ל-cDNA דו-גלי, נוצרו כמויות מספיקות של חומר עבור ריצוף וניתוח של תמלילים סביבתיים. כעת הצגנו כיצד להעריך ביטוי גנים של קהילות מיקרוביאליות ימיות באמצעות מטא-טרנסקריפטומיקה סביבתית.

זכרו תמיד כי בעת ביצוע פרוצדורה זו, ה-mRNA מתפרק במהירות ו-RNAs נמצאים בכל מקום. לכן, נקטו באמצעי זהירות סטנדרטיים לעבודה בסביבה נקייה מריבונוקלאז (RNase-free) ועבדו עם הדגימות במהירות האפשרית. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.