Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

שלום, שמי אנה ואנו מבצעים באופן שגרתי פרופיל ביטוי גנים במעבדה. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לנטר גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בין meth לסוג הפרא (wild type). כיום יש בידיי דגימות RNA של סוג פרא ושל meth, ואנו נבצע תחילה C.

אנו משתמשים בשיטות סימון עקיפות, והיתרון של טכניקה זו הוא מניעת הטיות של הצופה שעלולות להתרחש בסימון ישיר. לשם כך, אנו משתמשים בדגימות RNA, כאשר אנו שואפים להשיג 3 µg של RNA בנפח כולל של 13 µL. אנו מוסיפים 2.5 µg של random hexamers לתערובת.

נדגירה של הדגימה בטמפרטורה של 75°C למשך שמונה דקות כדי להדnaturize את ה-RNA. כעת נוסיף את תערובת ה-reverse transcription הכוללת AM L-D-L-D-U-T-P continu mix, בופר reverse transcriptase וכן ET TT, נערבב באמצעות vortex ונדגיר את הדגימה ב-42°C למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות נוציא את הדגימות.

כעת יש לנו במבחנה תערובת של cDNA ו-RNA. כעת נבצע הידרוליזה של ה-RNA על ידי הוספת נתרן הידרוקסיד ו-EDTA, כאשר הריכוז הסופי של נתרן הידרוקסיד צריך להיות 100 mM והריכוז הסופי של EDTA צריך להיות 5 mM.

כעת נדגרי את הדגימות במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות. כעת, לאחר שהדגירה הסתיימה, נשתמש בדגימות על ידי הוספת HEPES pH 7 במים עד לריכוז סופי של 500 mM. בשלב זה ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 °C או להמשיך לשלב הניקוי.

לניקוי ה-CDNA, אנו משתמשים בערכה לטיהור PCR של KaiGen. עם זאת, מכיוון ש-Bush buffer ו-ion buffer מכילים פנול, אנו מכינים בעצמנו phosphate bush buffer ו-phosphate ion buffer; יש להוסיף 300 µL של PPI ולהעביר זאת באיטיות באמצעות פיפטה. לאחר מכן, העבירו את התערובת לעמודות וסובבו במשך דקה במהירות המקסימלית. השתמשו בבופר השטיפה שהכנו, Phosphate wash buffer; הוסיפו 750 µL, ולאחר מכן הוסיפו כמות נוספת וסובבו שוב למשך דקה.

לכן נסבב שוב כדי לוודא שכל התוכן שקע. ואנו נעביר את המבחנות הללו למבחנות Eppendorf ריקות. ואוסיף 30 µL של phosphate buffer E, שהוא 40 mM של אשלחן פוספט ב-pH 8.5.

כעת עליכם לוודא שאתם מוסיפים את הכל למרכז העמודה, ותדגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לכן, המכשיר יסבב שוב למשך דקה אחת, ואני אוסיף עוד 30 µL של באפר. אני מדגירה בטמפרטורת החדר. כעת אני מסירה את העמודה, ויש לנו נפח כולל של 60 µL של CDA.

לאחר ניקוי ה-CDNA, ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של 20- מעלות, או לייבש אותו ולאחר מכן לאחסנו, כך שניתן לייבש את ה-CDNA ב-feedback. כעת יש לנו במבחנה CDNA יבש, אשר עבר מודיפיקציה. כעת אסחף את הדגימה היבשה ב-.

אשעה את הדגימה ב-10 µL של 15 mM ביקרבונט ב-pH 9. אעשה זאת על ידי פיפטאژ מעלה ומטה; בשלב זה, חשוב מאוד לערבב היטב את ה-cDNA כדי שתגובת ה-incorporation תעבוד. תגובה זו צריכה להתבצע בחדש חשוך, מכיוון שתוויתים פלואורסצנטיים רגישים לאור.

עם זאת, הבחירה באלו ממדעי החיים פירושה שהם הגיעו באריזות בודדות. ל-S5 יש פקק סגול ול-S3 יש פקק כתום; כמו כן, S5 נראה בצבע ציאן כאשר הוא מתמוסס ו-Cary נראה בצבע מגנטה. לכן, מה שאעשה בחדר חשוך הוא להעביר את הדגימות הללו למבחנות צבע, לתלה את הצבע מחדש ולהעבירם בחזרה למבחנה שברשותי.

לאחר מכן אדגיר בחושך למשך שעתיים. לאחר דגירה של שעתיים, אעצור את התגובה על ידי הוספת 35 µL של נתרן אצטט בריכוז 100 millimolar ב-pH 5.2. לאחר מכן ביצענו ניקוי באמצעות הליך ניקוי דומה. עם זאת, הפעם השתמשנו בתמיסות השטיפה והאלוציה שסופקו על ידי Qiagen.

ניתן לתאר את המקומות שבהם מניחים את הדגימה ואת התהליך שנועד לנקות את המכשיר. לכן, ניתן להכניס את הדגימה או את התערובת כעת. זוהי הדגימה שלי המסומנת ב-scifi, וכאן אנו רואים OD 260, המעיד על תכולת ה-CDA, ו-OD 650, המעיד על שילוב ה-D עבור scifi. וכאן נמצאת הדגימה המסומנת ב-side 3.

שוב, סבבו שש ריכוזים וחמש מדידות של 50 באתר שלוש שילוב. מכיוון שתאגיד D שלי עובד ביעילות, אשלב דגימות כעת, ערבבו אותן בקצרה. וכעת נכתוב דגימה שוב באמצעות משוב.

בסדר, כדי להכין את השקופית, נבצע רהידרציה על ידי הנחת השקופית על פני מים, מה שיהפוך את הכתמים לגדולים יותר. לאחר מכן, כדי להגן על כך, נייבש במהירות בטמפרטורה של 100 °C, ולאחר מכן נבצע היברידיזציית UV או קישור צלב (cross link) באמצעות UV של הכתמים לשקופית, ואז נדגור בבופר הפרה-היברידיזציה שברשותנו. אני מניח את השקופית כשהפנים כלפי מטה, אך היא עדיין לא נוגעת במים.

נמתין כך למשך חמש דקות. קופסה זו נראית גדולה יותר, הם צריכים להיות מבריקים יותר מאשר לפני שהנחתם, ותייבשו זאת במהירות על ידי הנחת השקופית בטמפרטורה של 100 °C ותבחנו אם קייב קונדנסציה. ולאחר מכן נבצע קישור צולב (cross link) באמצעות youi.

לצורך הידרציה, אני פשוט אטבול את השקופית במים חמימים. פעולה זו צריכה להיות מהירה מאוד, מכיוון שהמטרה כאן היא להסיר את כל הכתמים או את כל האוליגונוקלאוטידים בכתם שאינם מקושרים. אם תבצעו את התהליך הזה באיטיות, תיווצר לכם "זנבות של שביטים" (com tails) על הכתמים שלכם.

לכן, ודאו שאתם מבצעים זאת במהירות, והקפידו לא להוציא את הדגימה מהמים. בצעו זאת במשך 30 שניות, ולאחר מכן המתינו מיד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-700 rpm. כעת, נכניס את השקף לתמיסת הבאפר להרטבה מוקדמת שהכנו, נדחף את השקף לאט אל תוך הצנצנת, ונדגיר זאת ב-42 °C למשך 45 דקות לפחות. כאן יש לנו את הדגימה המיובשת להibrדיזציה. תחילה נבצע השהיה (resuspend) במים.

בשלב זה נבצע רק ריסוף על ידי העלאה והורדה של הנוזל, ויש להימנע מחשיפת הדגימה לאור. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 µL של DNA של זרע אדם בריכוז של 10 mg/ml, והוסיפו 1.2 µM של tRNA.

הריכוז הוא 12.5 milligram per, אנו מוסיפים tRNA ומספר דגימות של DNA של זרע כדי לחסום היברידיזציה לא ספציפית. אנו מוסיפים 5.35 marker zero three XSSC, דבר המביא לריכוז סופי של 3x. ולסיום, אנו מוסיפים 3.5 µL של 1%SDS.

כעת נרתיח את התערובת למשך חמש דקות ונסחרר במהירות המקסימלית למשך חמש דקות, ואז הדגימה תהיה מוכנה. עברה שעה מאז דגירה של השקף, וכעת יש לי מים ואיזופרופנול. לכן, אטלטל את השקף תחילה במים כדי להסיר את ה-SDS, לאחר מכן אשטוף באיזופרופנול ואעבירו ישירות למסגרת הסטנדרטית.

וכאן, רק היזהרו שלא לחשוף את הדגימה לאוויר יותר מדי כדי למנוע התייבשות. לכן אני עובר ישירות מתוך תמיפת ה-harm station buffer אל המים ושוטף את השקופית. למשך מספר דקות, רק ודאו שהתנועה היא רק למעלה ולמטה, ולא לצדדים.

כמו כן, ודאו שהשקף אינו טבול במים והעבירו אותו מיד לאיזופרופנול. השאירו אותו שם למשך מספר דקות נוספות. לאחר מכן, נא להמתין בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

700 R.Cool. כך שגם השקופית שלנו מוכנה להיברידיזציה, ומומלץ לשמור אותה בתיבת שקופיות כדי להגן עליה מפני אבק. עבור תחנת הקצירה נשתמש ב-lift או ב-slip.

ישנם פסים לבנים על לביבת הזכוכית (cover slip), שיספקו גובה מסוים ויאפשרו מרחב לדגימה שלנו להיכנס בין לביבת הזכוכית לבין השקופית. אני מנקה זאת בעזרת אתנול ואז מניח את הרשת, תוך כדי וידוא שאין חלקיקים זרים. ראשית, ניקח את שקופית התבנית שבה מסומן אזור ההדפסה, ומעליה נניח את השקופית שהכנו ונוודא שהן מיושרות באופן מושלם.

וודאו שהם מיושרים באופן מושלם. עליכם לוודא שהפסים נמצאים בצד, שכן אנו נניח אותו הפוך. קשה מאוד לראות זאת, אך וודאו שאתם מצליחים להבחין בהם.

הפסים צריכים להיות בצדדי השקופיות. אנחנו נטען את הדגימה שלנו מהצדדים. אני לוקחת כמויות קטנות של דגימה, כך שאני לוקחת 15 µL תחילה ומתחילה בטעינה מהפינה של זכוכית הכיסוי.

אמשוך זאת באיטיות ואנוע לאורך השפה כדי לכסות את כל השטח. בשלב זה חשוב מאוד לא להכניס בועות, ואני לוקח 15 µl נוספים של מיגטור (migrator) ומחיל אותם לצדי השקופיות כדי למנוע התייבשות. כעת הדגימה שלנו מוכנה, ואת השקופיות נדגרי בתוך תאי תעדוף, הכוללים מיקרו-תעלות להגיית השקופית בזמן ההכלה (hybridization).

נוסיף 10 מיקרומטר של 3X SSC לשש פינות של השקופית. היו שש נקודות בתא, סליחה, בכל פינה ובכל צד. ודאו שאתם מעבירים את השקופית בעדינות רבה כדי שהזכוכית המכסה לא תחליק. כאשר תניחו את השקופית בצורה ישרה, תראו שהיא תיצמד למים שהוספתם, והניחו את המכסה. ודאו שהברגים מהודקים.

נדגרי את תא השיחה בשק מים בטמפרטורה של 65 °C, אך איננו רוצים להניח אותו ישירות על התחתית. לכן, נניח סוג של מחסום פלסטיק כדי למנוע מעבר חום מופרז. נמקם את תא האיזוציה בעדינות, וכדי למנוע כל תזוזה, ניתן להניח סוג של משקולת.

דגירה זו תימשך לילה שלם, בדרך כלל בין 10 ל-12 שעות. לשטיפת הפרוסות, נשתמש ב-1X SSC עם 0.05% SDS. שלב זה נועד להסרת זכוכית הכיסוי.

זה ישמש לשטיפה בשלב הראשון. נבצע שני שלבים נוספים עם 0.06%six XSC בלבד, דרך כל ה-SDS שיש לנו. לאחר מכן נסיים את התהליך, ניקח את השקופיות ונניח אותן כשהצד הפונה כלפי מטה בתוך המיכל.

נסלק אותו מצד לצד ונראה שהכיסוי יסתיר את עצמו וינשור בעדינות. כעת, נעביר אותו למסיינא של תמיסת שטיפה אחרת המכילה XES. נמתין למשך דקה אחת.

עברו לשלב שש ב-XSSC. ורק כדי לוודא שהסרנו את כל ה-FDS, נחזור על הפעולה פעם אחת נוספת. סובבו בצנטריפוגה לייבוש בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-700 RP. שמרו את השקופית הזו בקופסת השקופיות כיוון שהיא רגישה לאור.

זהו סורק שקופיות, והשקופית תוצב כאן, בחלל הקטן הזה, כאשר הפנים פונה כלפי מטה והתווית פונה כלפי חוץ. ובשקופית השנייה תגדירו את האזור שברצונכם לסרוק. נבחר את האזור הזה בשקופיות שלנו; אנו משתמשים ב-16 פינים להדפסת השקופיות שלנו.

כך שכל בלוק תואם לפין אחד, והשקופיות שלנו מכילות למעלה מ-8,000 נקודות. אנו מייצגים את הגנום של vi color פעמיים כיוון שישנם כ-4,000 גנים. לכן, ישנן שתי נקודות עבור כל אוליגו שבו אנו משתמשים.

ואם נבצע זום, תוכלו לראות שבניסוי ספציפי זה, אנו משווים מוטנטים של רגולטורי תעתוק לסוג בר (wild type), כאשר המוטנט סומן ב-scifi, שמעניק צבע אדום. הסוג בר סומן ב-site three, שמעניק צבע ירוק. לכן, כל דבר שנראה אדום, כמו הנקודות הללו, מעיד על כך ששכיחות התעתוקים במוטנט הייתה גבוהה יותר מאשר בסוג בר.

לכן הם נראים באדום או בגווני אדום, וכל דבר שנראה בירוק מעיד על כך ששפע התמלול היה גבוה יותר בסוג הפרא בהשוואה למוטנט. וכל נקודה שנראית בצהוב מעידה על כך שהתמלול היה נוכח במידה שווה הן במוטנט והן בסוג הפרא. לכן, כאשר הם חופפים, הם ייראו צהובים כמו הנקודות הללו.