שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

כדי להפיק רישומים אלקטרופיזיולוגיים יציבים מצומת עצב-שריר של פקעות Joof. ראשית, יש לבצע דיסקציה של הפקעה כדי לחשוף את דופן הגוף, השרירים ומערכת העצבים לפני הרישום. יש לחתוך את האקסונים בבסיס ה-CNS אחורית לגנגליון הוונטרלי.

לאחר מכן, מניחים אלקטרודת רישום על השריר הנבדק ואלקטרודת גירוי בקרבת הנוירונים המוטוריים המעצבבים אותו. האקסונים הקטועים של הנוירונים המוטוריים נשאבים אל תוך פיפטת הגירוי. לאחר מכן ניתן לרשום פוטנציאלי צומת מעוררים.

שלום, אני Wendy MLA ממעבדת McCabe במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה תאית באוניברסיטת קולומביה. היום נדגים לכם פרוטוקול למדידת תמסורת סינפטית בצומת העצבי-שרירי של GE lava. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית ותמסורת עצבית.

אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בניסוי, בצעו דיסקציה של זחלים בשלבי wandering third ו-star כדי לחשוף את דופן הגוף. פרוטוקול זה הותאם לניסויי אלקטרופיזיולוגיה באמצעות שימוש בסיכות דיסקציה קצרות.

אלה הם באורך של כ-שני עד ארבעה מילימטרים, והסבירות שהם יפגעו בעדשת המיקרוסקופ או באלקטרודות במהלך הניסוי נמוכה יותר. לאחר חשיפת דופן הגוף, השתמש בפינצטה כדי להחזיק את ה-CNS ולהרים אותו מעט. לאחר מכן, חתוך את האקסונים המוטוריים של העצבים ההיקפיים והסר את המוח.

לאחר הוצאת המוח, שטפו את הדגימה המנותחת פעמיים בבופר HL 3.1 עם 1 mM סידן. כעת, לאחר השלמת הניתוח, ניתן לבצע הקלטות תוך-תאיות מתאי השריר של הזחלים. הניחו את פלטת הניתוח על מיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגיה והטבילו את הדגימה בבופר HL 3.1 בתוספת סידן.

לאחר מכן, קבעו את אלקטרודת האמבט כך שתהיה במגע עם התמיסה. אלקטרודת היניקה משמשת לעיבור של העצבים ההיקפיים המעצבבים את השריר. מקמו תחילה את אלקטרודת היניקה בצלחת כדי למנוע רעידות בעת הנחת האלקטרודה התוך-תאית על השריר.

ברגע שהאלקטרודה נמצאת בצלחת, מקמו אותה קרוב לנוירון המוטורי המעצב את שריר שש. במקטע הבטני השלישי, הפעילו שאיבה עדינה עד שהעצב החתוך ייכנס לתוך הפיפטה מזכוכית. היזהרו לא למתוח את העצבים בעת הפעלת השאיבה.

הרם את הפ pipette מעט כך שלא תיגע בשריר. לאחר מכן, מקם אותה כך שלא תמשוך את סיבי העצב החתוכים. ברגע שאלקטרודת היניקה במקומה, מקם את אלקטרודת ההקלטה עבור ההקלטות התוך-תאיות.

השתמשו במיקרו-אלקטרודה חדה הממולאת ב-potassium chloride בריכוז three molar. מקמו את אלקטרודת ההקלטה מעל מרכז שריר שש. כווננו את ה-input offset כך שירשום אפס עבור תמיסת הרחצה.

הורד לאט את האלקטרודה והקרב אותה אל השריר תחת הגבלה אופטית גבוהה עד שהיא תיגע במשטח השריר. כדי לוודא שהאלקטרודה חדרה לשריר, עקוב אחר האוסצילוסקופ. פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה צריך להיות לפחות 60- millivolts.

כעת אמור להיות נראה פוטנציאל מנוחה מינימלי ספורדי. לאחר שהאלקטרודה להקלטה במקומה, המתן דקה לייצוב התאים. לפני תחילת ההקלטות, השתמש ב-axon HS two, head stage ובמגבר axle clamp two B כדי לזהות שינויים בפוטנציאל הממברנה.

מתג clamp two B מחובר למחשב המריץ את תוכנת P clamp באמצעות ה-digit data. 1322 A, הממיר את האות לערכים דיגיטליים. רשום את פוטנציאל הממברנה במחשב PC. באמצעות תוכנת clamp X, החל גירויים על האקסון המוטורי כדי ליצור פוטנציאלים ממברנתיים מעוררים או ejs.

לאחר יצירת ה-ejs, הקליטו את ה-ejs המיניאטוריים לאורך תקופה של שלוש דקות ללא סינפסיס של גירויים. ניתן להשתמש בתוכנת Soft mini analysis כדי לנתח את העקבות ולקבוע את האמפליטודה והתדירות של ה-mini EJP. כדי ליצור ejs.

השתמש במחולל פולסים ראשי בן שמונה ערוצים כדי לעורר את הקצה הקטוע של נוירון מוטורי. הגדר את המחולל למסירת פולסי מתח ריבועיים של 0.3 millisecond. הגדר מרווח של חמישה שניות בין הגירויים כדי לאפשר התאוששות סינפטית.

בצומת העצבי-שרירי (NMJ), רשמו לפחות 10 פוטנציאלים מעוררים מכל שריר וחשבו את ממוצע האמפליטודות. איור זה מציג רישום טיפוסי שנלקח משריר מספר שש של פupa מסוג wild type של sal, הכולל תגובות EJP מעוררות ו-mini EJPs ספונטניות. הרגע הצגנו לכם כיצד לרשום פוטנציאלים מהצומת העצבי-שרירי של זחלי דרוזופילה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשלים את הדיסקציה תוך 3 עד 10 דקות ולהתחיל את הרישומים האלקטרופיזיולוגיים באופן מיידי, בעוד התאים עדיין בריאים ומגיבים.

אם הנתיחה תימשך זמן רב מדי, פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה של תאי השריר יהיה נמוך מ-60- millivolts, ערך שהוא נמוך מכדי שניתן יהיה להקליטו. וזהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.