Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

הליך זה מתחיל בגידול זבובים מסוג drosophila. זחלים בשלב ה-Third instar בעלי הגנוטיפ המתאים גודלים על מזון המכיל all trans retinol. כל זחל מקובע באמצעות סיכות בראשו ובזנבו.

לאחר מכן פושט ה-FLA. המוח והעצבים האחוריים נחתכים כדי להפסיק את הפעילות המוטורית הקצבית. לאחר מכן, מקור אור ה-LED הכחול עם תיבת הבקרה מכוון וממוקד על הדגימה.

לבסוף, השתמש באלקטרודה חדה כדי לדקור את שריר שש. לאחר מכן, העבר פולסי אור באמצעות מקור מתח. שלום, אני ניקולס מרסטיין מהמעבדה של ד"ר לסלי גריפית', המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ברנדייס.

שלום, אני סטפן פולבר, גם אני ממעבדת Griffith. היום נראה לכם את הפרוצדורה לעירור פוטנציאלים סינפטיים בהיעדר channel root absent two בצומת העצבי-שרירי של זחלי drosophila. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית ב-drosophila.

אנו משתמשים בשיטה זו גם כדי ללמד סטודנטים פיזיולוגיה סינפטית ובמעבדות הוראה. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, תחזיקו זני זבובים של UAS channel redsin two ו-3 7, 1 gal four בבקבוקים נפרדים המכילים מצע גידול סטנדרטי לזבובים.

אספו זבובים בתולים מ-3 7, 1 gal, ארבעה קווי זבובים וזכרים מערוץ UAS channel redsin. שני קווים. לאחר מכן, הכינו מצע מזון לזבובים המעורבב עם 1 mM all trans retinol או ATR. כדי לעשות זאת, המיסו מצע מזון רגיל לזבובים במיקרוגל למשך כדקה אחת.

לאחר ההמסה, יש להמתין שתווך הצמיחה יתקרר למשך כ-30 עד 60 שניות, ולאחר מכן להוסיף 100 µL של a TR בריכוז 100 mM ב-100% ethanol עבור כל 10 mL של מצע מזון לזבובים. כאשר המבחנות המכילות את מצע ה-a TR מוכנות, יש להעביר את הזכרים והנקבות שנאספו לכל מבחנה. יש להניח את המבחנות במקום חשוך בטמפרטורה של 22 עד 25 °C כדי לאפשר לזבובים להזדווג ולהטיל ביצים; המתינו ארבעה עד חמישה ימים עד להופעת לרוקים בשלב instar השלישי.

בשלב זה, ניתן להשליץ את הזבובים הבוגרים. כעת אנו מוכנים להמשיך בהקמת מערך האלקטרופיזיולוגיה. חברו כל עדשה של מיקרוסקופ דיסקציה למקור אור LED כחול עם גוף קירור.

השתמשו במוט ובסרט להידוק בסיס מגנטי לעינית ולמקור אור LED. הניחו את הבסיס המגנטי על שולחן האוויר של מערכת האלקטרופיזיולוגיה. לאחר מכן, חברו את מקור האור למעגל בקרה, ואת מעגל הבקרה למקור מתח חיצוני.

אנו משתמשים ביציאת המתח ממערכת רכישת נתוני אלקטרופיזיולוגיה מסוג PowerLab המיוצרת על ידי AD Instruments. לאחר החיבור למקור המתח, יש להעביר פולסים של 1 עד 5 וולט למעגל הבקרה כדי להפעיל את האור הכחול, ולאחר מכן יש לכוון את הבסיס המגנטי ואת מקור האור עד שקרן האור הכחול תהיה ממוקדת באזור שבו תבוצע נתיחת הזחלים. לאחר ביצוע הכיוונונים המתאימים, ניתן לעבור לשלב נתיחת הזחלים.

כדי להתחיל בנתיחה, מקמים שישה סיכות במידה של 0.1 מילימטר לתחתית של צלחת המרופדת ב-sogar. מוציאים זחלים בשלב שלישי של star מהמצע המזון ומניחים אותם בכל צלחת פטרי מפלסטיק. שוטפים את הזחלים בתמיסת סליין כדי להסיר שאריות מזון הדבקות אליהם.

לאחר מכן, הניחו את הזחלים בצלחת הניתוח בקרבת הנעצים שpulled ומלאו את הצלחת עד מחציתה בתמיסת סלין. כעת, כווןו את הזחלים כך שתוכלו לראות שני צינורות כסופים העוברים לאורך הגב של בעל החיים. צינורות כסופים אלו הם הטרכאה (trachea).

החדירו סיכה גדולה ישירות לזנב, בין צינורות הנשימה (tracheal tubes). החזיקו את הזחלים כלפי מטה והחדירו סיכה גדולה שנייה לראשם. ודאו כי הגוף נמתח לאורכו בעת החדרת הסיכה.

השתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן ליד הזנב. המשך את החתך לאורך הגוף. וודא שקצות המספריים מורמים כדי למנוע פגיעה בעצבים הוונטרליים ו/או בשרירי דופן הגוף.

מקם ארבעה סיכות בארבעת הפינות של בעלי החיים. כעת פתח את החלק המרכזי. תקע את הסיכות לתוך צלחת הנתיחה כדי להכין את בעל החיים כפילה.

בנוסף, מקבעו את הדגימה כך שניתן יהיה להשתמש בפינצטה ובמספריים. הסירו את איברי העיכול של בעל החיים, את הקנה ואת גופי השומן. שטפו את הדגימה בתמיסת סלין.

לאחר השטיפה, אתרו את האונות הפרונטליות ואת הגנגליון הוונטרלי של הדגימה באמצעות מספרי מיקרו. גזרו בזהירות דרך הגנגליון הוונטרלי, מיד מאחורי האונות הפרונטליות. עם השלמת הדיסקציה, המשיכו לגירוי באור כחול ולהקלטת שרירים.

לביצוע רישום השריר, משוך אלקטרודה בעלת התנגדות של 10 עד 20 mega ohm. בעזרת מכשיר למשיכת אלקטרודות אלקטרוני, מלא את האלקטרודה שנמשחה ב-KCL בריכוז three molar. מקם את האלקטרודה המלאה במחזיק האלקטרודות.

כעת הניחו את תכשיר הזחלים תחת מיקרוסקופ דיסקציה על גבי המתקן. כווננו את האור הכחול כך שתכשיר הדיסקציה יהיה ממורכז בקרן האור. זהו את שריר 6 או M6 בכל מקטע של דופן הגוף של הזחל; בעזרת מיקרו-מניפולטור, הכניסו בזהירות אלקטרודה לתוך M6 ועקבו אחר היפר-פולריזציה מהירה של השריר.

פוטנציאלי ממברנה במצב מנוחה צריכים להיות בטווח שבין 30- ל-70- millivolts. לאחר שהאלקטרודה הוחדרה כראוי, יש להעביר פולסי מתח של 20 עד 100 millisecond למעגל הבקרה. העלה באופן הדרגתי את המתח המסופק למעגל הבקרה.

חפשו פוטנציאלי צומת מעוררים בתא השריר. להלן תוצאה מייצגת המראה פוטנציאל צומת מעורר שנוצר על ידי פולסי אור קצרים. אמפליטודת פוטנציאל הצומת המעורר המוצגת כאן היא סכום האמפליטודות של שני נוירונים מוטוריים ששניהם ידועים ככאלה המפעילים את התא.

M six. עוצמות נמוכות יותר או משכי אור קצרים יותר עשויים לחשוף את פוטנציאל הצומת המעורר בעל האמפליטודה הקטנה יותר מנוירון מוטורי בודד. הרגע הדגמנו כיצד לבצע סטימולציה של פוטנציאלים סינפטיים בצומת העצבי-שרירי של ה-oph באמצעות channel road absent two.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מפגיעה בדופן הגוף של הדגימה במהלך הניתוח. כמו כן, חשוב לזכור שלמרות שהדגימה עשויה להיות במצב של גירוי-יתר מיד לאחר הניתוח, היא תירגע עם הזמן ותאפשר הקלטות תקינות. בעת דקירת השרירים, יש להיזהר לא לחדור מתחת לשכבת השרירים הראשונה אל תוך דופן הגוף.

כאשר האלקטרודה שלכם תקועה בדופן הגוף, תוכלו לעיתים לקבל פוטנציאלים בהיפר-פולריזציה (hyperpolarized potentials) למרות שאינכם נמצאים בפועל בתוך תא שריר. זהו ההסבר לכך.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.