שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

כדי לחתוך אקסונים באמצעות דימות דו-פוטוני In vivo, מקמיים עוברים של דגי זברה המורדמים בתוך טיפה של agarose בעוד היא מתקשה בתא ייעודי המורכב מתושבת TEFL וכיסוי זכוכית (cover slip). פלטת זכוכית מונחת על גבי התא, אשר הופך לאחר מכן למצב הפוך לפני ביצוע ה-axotomy. צלמו תמונת "לפני" של האקסון שברצונכם לחתוך בהגדלה של 40x, ולאחר מכן הגדילו ל-70x באזור שבו ברצונכם לבצע את ה-axotomy.

כאשר הלייזר כבוי, הגבירו את הספק הלייזר. הפעילו את הלייזר לזמן קצר. בתמונת השאריות (after image) של האקסון, תראו שברים אקסונליים מפוזרים אם האקסוטומיה הצליחה.

שלום, אני ג'ורג'יה אובריאן. שלום, אני סנדרה ריגו. ואני שונה מרטין.

אנחנו מהמעבדה של Alvarez TI במחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית באוניברסיטת קליפורניה לוס אנג'לס. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע ex sodomy בדו-פוטון ודימוי קונפוקאלי בשיטת time lapse בעוברים חיים של דגי זברה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור דגנרציה ורגנרציה של אקסונים סומטוסנסוריים פריפריאליים.

בואו נתחיל. ראשית, נכין תמיסת agarose low melt בריכוז 1% לצורך הטמעה. נהמס את ה-agarose במים מזוקקים כפולה (double distilled water) על ידי חימום במיקרוגל, לפני שנחלק את התמיסה לשפופרות קטנות ונשמור אותן בבלוק חימום בטמפרטורה של 42 °C.

ניתן להעביר את העוברים הראשונים לתמיסת רינגר עם 5% PTU כ-22 עד 24 שעות לאחר ההפריה כדי לעכב את היווצרות הפיגמנט, אשר מאופיין בפלואורסצנציה עצמית חזקה העלולה להסתיר את האקסונים במיקרוסקופ דו-פוטוני. לאחר מכן, נבחר את העוברים לדימוג ונסיר את המעטפת (chorion) על ידי הפרדה עדינה בעזרת פינצטה. לאחר בחירת העוברים, הם יאלחוש על ידי הוספת כ-0.02% tricaine לתמיסת הרינגר עם ה-PTU.

לפני ההמשך, ודאו שהבעליים אינם מגיבים למגע. הכינו את תא הדמיה לטווח ארוך על ידי מריחת גריז ואקום על צד אחד של טבעת זכוכית או טפלון וקיבועה על לבישת זכוכית. יש להקפיד שלא להעביר כמות גדולה של PTU ringers.

העבירו עובר אחד אל תמיסת ה-agro בטמפרטורה של 42 מעלות באמצעות פיפטת זכוכית. לאחר מכן, העבירו את העובר עם טיפה אחת של agros אל על זכוכית כיסוי מוכנה. לאחר ההעברה, מנחו את העובר כרצונכם בזמן שה-agros מתקשה.

שימו לב כי תא הדמיה יתהפך בסיום הפעולה, כך ששקופית הנחושת תהיה השטח העליון. אם ברשותכם במה ממוטרת ואתם יכולים להדמה מספר מיקומים בו-זמנית, חזרו על שלבים אלו עבור כל עובר. המתינו עד שה-agarose יתמצב לחלוטין.

לאחר מכן מלאו את הטבעת ב-0.02%tri canine PTU ringers. לבסוף, מרחו גריז ואקום בצדו השני של הטבעות. לאחר מכן כסו אותן בזכוכית תאורה.

הפכו את תאי האיטום. כעת אנו מוכנים לדימות של שני עוברים בשלב ה-four ton exo tomy. כדי להכין את הדגימות לדימות, הניחו את העוברים המקובעים על תומך למשקופיות תחת המיקרוסקופ.

בצעו מיקוד על עובר אחד באמצעות עדשת מים 40 x 0.8 numerical aperture. לאחר מכן, הפעילו את הלייזר. הגדירו את הלייזר לאורך גל של 910 nanometers ולהספק של 30 milliwatts.

פתחו את תוכנת ההדמיה. אנו משתמשים בתוכנת סריקת תמונות שפותחה במעבדתו של Boar עבור אלמוגים. בהגדלה זו, ניתן לסרוק את השדה כדי למצוא אקסון מועמד לניתוק.

ברגע שנמצא, צלם תמונה של האקסון המטרה. סמן את מיקומי ה-Z הראשוניים והאחרונים, רכוש את התמונה ובצע הקרנה מקסימלית (maximum projection) של ה-Z stacks. לאחר מכן, בצע זום של 70x על ענף האקסון שברצונך לבחון בפירוט.

העלו את ההספק ל-180 milliwatts והגדירו את מספר פרוסות ה-Z לאחת. התחילו סריקה בודדת באמצעות הלייזר על ידי לחיצה על grab. פעולה זו אמורה להספיק כדי לחתוך את האקסון, עם זאת, יש לבצע אופטימיזציה של הליך זה עבור המיקרוסקופ שלכם והמטרה הניסויית.

לבסוף, בצעו זום-אאוט. הפחיתו את ההספק ל-30 milliwatts וצלמו תמונה של האקסון שניתק acabado. אם במעבדה שלכם אין מיקרוסקופ דו-פוטוני שנבנה בהתאמה אישית, ניתן להשתמש גם במיקרוסקופ הקונפוקאלי הדו-פוטוני Zes five 10 כדי לנתק אקסונים.

נתחיל בהנחת העובר המורכב על הבמה והבאתו למיקוד באמצעות עדשת מים 25 x. לאחר מכן, הדליקו את לייזר ה-two photon ואת לייזר ה-Argonne בהגדרה של רב-ערוצית (multi-track), כך שניתן יהיה לעבור מאחד לשני. למרות ששני הלייזרים משמשים לזיהוי GFP, פליטת ה-two photon מוצגת בצבע אדום ופליטת לייזר ה-Argonne מוצגת בצבע ירוק.

על מנת להבדיל ביניהם, השתמש בלייזר של Argonne כדי לזהות אקסון שניתן לבחון תחת הגדרות Z. סמן את החתכים האופטיים הראשונים והאחרונים. צלם תמונה קונפוקלית וצור השלכה מקסימלית (maximum projection) של ה-Zack.

כבה את לייזר הארגון והפעל את סריקת לייזר הפוטונים הכפולים בעוצמה של כ-9% transmission. כדי לוודא שהאקסון עדיין במיקוד, לחץ על כפתור העצירה (stop) כדי שיהיה ניתן להשתמש בכלי החיתוך (crop). השתמש בכלי החיתוך כדי להגדיל את אזור העניין.

בדרך כלל אנו מזומזמים לכ-70 x. בחרו את אזור האקסון שיועבר לפגיעה והביאו אזור זה לפוקוס. ניתן לבדוק את רמת הזום תחת לשונית המצב (mode).

בשלב הבא, תחת לשונית הערוצים (channels), שנו את עוצמת הפוטונים הכפולים (two photon) משידור של כ-9% ל-15% עד 30% שידור. כדי להפעיל את ההגדרות החדשות, לחצו על כפתור fast XY ולאחר מכן לחצו במהירות על stop. כדי למנוע נזק מופרז, האקסון צריך להיראות כשברים מפוזרים אם הפרוצדורה הצליחה.

לבסוף, כדי לוודא שהאקסון אכן נפגע, חזרו ללייזר ה-Argonne ב-488 nanometer. צלמו תמונת קונפוקלית נוספת וצרו השלכה מקסימלית (maximum projection) של הצירים. כעת, לאחר שהדגמנו שתי דרכים לניתוק אקסונים באמצעות מיקרוסקופיית לייזר דו-פוטונית, נבחן דימות קונפוקלי של התחדשות בשיטת TimeLapse באמצעות ה-Zeiss LSM 510.

להכנת דימוי במרווחי זמן (time lapse), ודאו שהבמה המחוממת דלוקה לפחות 30 דקות לפני הגדרת סרט ה-time-lapse. הניחו את העוברים המקובעים על תומך למשטחות תחת המיקרוסקופ. התמקדו בעובר אחד באמצעות עדשת האוויר הרצויה.

אנו משתמשים בעדשה אובייקטיבית בעלת מפתח מספרי של 20 x 0.5, פותחים את תוכנת ההדמיה Zeiss LSM five ולאחר מכן מדליקים את הלייזרים המתאימים ומגדירים את התצורה הרצויה. פתחו את שלב הסריקה ואת חלונות ה-multi-time. אם ברשותכם תוכנת multi-time, הגדירו את המיקום והתצורה של העובר הראשון בחלון ה-multi-time.

הפעלו את הסריקה המהירה (fast scan) בחלון הסריקה, ולאחר מכן העבירו את הבמה למיקום XY הרצוי. סמנו את מיקומי Z הראשונים והאחרונים בחלון הסריקה. לחצו על עצירה (stop) ולאחר מכן על אמצע (mid) גם כן בחלון הסריקה, והמתינו לסיום הסריקה של פרוס Z האמצעית.

לאחר מכן לחצו על mark position בחלון הבמה. אם אתם מדמיינים עובר אחד בלבד, לחצו על לשונית single location בחלון multi-time. לחצו על replace X, y, Z. לאחר מכן לחצו על save configuration.

אשרו כאשר תתבקשו לדרוס את התצורה הקודמת. כעת תוכלו להגדיר את הפרמטרים לרכישת תמונות בחלון ה-multi lo. אם ברשותכם במה מכנית, תוכלו להגדיר מספר מיקומים לצילום של מספר עוברים.

במקרה זה, יש לבחור בלשונית המיקומים המרובים (multiple locations) לפני הגדרת ערכי ה-X, Y, Z והקונפיגורציה עבור המיקום הראשון. כמו כן, ודאו כי התפריט הנפתח שנמצא מיד מתחת ללשונית המיקומים המרובים מכוון למיקום אחד (location one), וכי התפריט הנפתח בסעיף הקונפיגורציה מציין מיקום רב אחד (multi lo one). לפני הלחיצה על שמירת קונפיגורציה (save configuration), הגדירו את המיקום והקונפיגורציה של שאר העוברים בחלון הרב-זמני (multi-time window).

אתרו את סריקת המהיר (fast scan) הבאה של לחיצת העובר, לאחר מכן העבירו את הבמה למיקום XY הרצוי וסמנו את מיקומי Z הראשון והאחרון בחלון הסריקה. לחצו על stop. לאחר מכן לחצו על mid גם כן בחלון הסריקה, והמתינו לסיום הסריקה של פרוסת Z האמצעית.

לאחר מכן לחצו על mark position. בחלון הבמה (stage), לחצו על replace X, Y, Z. ודאו שהתפריט הנפתח ממש מתחת ללשונית multiple locations מכוון ל-location two ושהתפריט הנפתח בסעיף ה-configuration מציין multi lobe two. לאחר מכן לחצו על save configuration. אשרו. כאשר תתבקשו לדרוס את התצורה הקודמת, חזרו על תהליך זה עבור שאר העוברים.

הגדירו את הפרמטרים לרכישת תמונות בחלון multi lo. בחרו באפשרות GR GL מרשימת block section. לאחר מכן, הזינו את מספר חזרות הקבוצה הרצוי.

זהו מספר הפעמים שבהם המיקרוסקופ הקונפוקאלי ירכוש תמונה בכל מיקום. הזן את מרווח ההמתנה הרצוי בסעיף הפרמטרים. זהו פרק הזמן שחל מההתחלה של חזרת דימוי אחת ועד להתחלה של הבאה.

בחר ב-Zack XY בסעיף התצורה (configuration). הזן את שם קובץ הבסיס שלך בסעיף התחתון. לחץ על select image db ובחר את מסד הנתונים שלך.

לחצו על כפתור האפשרויות, ולאחר מכן בחרו את תיקיית ה-MDB שלכם לשמירת קבצים זמניים. סמנו את האפשרות להשאיר את התמונה הסופית פתוחה. שמרו את התמונה הסופית, מרכז ה-Zack ובחרו את מרווח המשקל.

לחצו על אישור כדי לסגור את חלון האפשרויות, ולאחר מכן לחצו על זמן ההתחלה (start time). השאירו את חלון מספר הזמנים פתוח למשך כל תקופת הדמיה. כעת הגיע הזמן לנתח את הנתונים שלכם.

עם סיום הדמיון בשיטת time-lapse, תוכנת ה-multi-time תרכז את כל הקבצים הזמניים שלך לקובץ סיכום עבור כל מיקום. אם ברצונך להפסיק את סרטון הווידאו לפני השלמתו, הקפד ללחוץ על finish במקום על stop כדי שייווצר קובץ סיכום.

קבצי הזמניים וקבצי הסיכום אמורים להישמר באופן אוטומטי בתיקיית ה-MDB הייעודית. להלן דוגמה מייצגת של סרט confocal בשיטת time lapse העוקב אחר ex otomy ב-54 שעות לאחר ההפריה. הפריים הראשון מציג מבט גבי של האקסון לפני ה-ex otomy, כאשר חץ צהוב מצביע על אתר ה-ex otomy בנקודת הזמן הבאה.

סרט ה-Lapse מתחיל בתוך שעה לאחר ה-ex otomy ונמשך 12 שעות. סט (stack) קונפוקלי אחד נאסף מדי 20 דקות. סרט קונפוקלי זה מוקלט באמצעות אותם פרמטרים ב-78 שעות לאחר ההפריה.

הפריים הראשון מציג מבט צידי של האקסון לפני ה-ex sodomy, כאשר חץ צהוב מצביע על אתר ה-ex sodomy. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לייצר נזק רקמתי מדויק ולהדגים עוברים חיים של zebrafish באמצעות two photon sodomy ודימויי confocal של time-lapse. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב למטב את עוצמת ההספק המשמשת ל-two photon laser ex sodomy כדי למנוע נזק עודף.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.