ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

ביטוי של רב-דיווחים פלואורסצנטיים בבעלי חיים טרנסגניים מאפשר לעקוב אחר תגובות תאיות למניפולציות ניסיוניות במודלים חיים של מחלות. כאן, אובדן תאים סלקטיבי מושרה באופן פרמקולוגי בדגי זהב, ומתועד באמצעות דימות קונפוקאלי רב-צבעי ברזולוציה גבוהה. תמונות של התאים המטרה ושכניהם המיידיים נרכשות לפני, מיד לאחר ובמרווחי זמן קבועים בעקבות הטיפול בתרופה; ניתוח התמונות מדגים את הפעלתן של אוכלוסיות תאי גזע אנדוגניים ואת החליפתם העוקבת של התאים המטרה במהלך שלב ההחלמה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרגנרציה, כגון מהם המנגנוים התאיים והמולקולריים המשמשים לרגנרציה של סוגי תאים מובחנים. התחל בהעברת ביצים טרנסגניות שנאספו מהזיווגים לצנחת פטרי המכילה תמיסת 0.3 x danio ב-16 שעות לאחר ההפריה. הוסף PTU כדי לעכב את פעילות ה-tyrosine ACE לפני הופעת כל עדות לפיגמנטציה ברקמה הרלוונטית. אם העובר אינו אלבינו, דגרי את העוברים בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius.

ברגע שהחלבונים המדווחים (reporters) נראים, הניחו את צלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו-זום פלואורסצנטי ומיינו את העובריים לפי ביטוי הגן החוץ-גנטי (transgene) הרצוי. לפני הצילום, הכינו תמיסת קיבוע aeros בריכוז 0.5% low melt בתוך תווך גידול לעובריים ואחסנו אותה בטמפרטורה של 40 °C.

הוסיפו trica ו-PTU במידת הצורך. ערבבו בעדינות והחזירו ל-40 degrees Celsius. הרדימו את הדגים על ידי הנחתם במצע עוברים המכיל trica.

במשך כשלוש דקות, הדגים יהיו חסרי תגובה. כדי לגעת בהם באמצעות מיקרופיפטה, שאבו דגים בודדים לתוך קצה פיפטה קצוץ בנפח של כ-30 µL של תמיסת הרדמה. לאחר מכן, הפכו את הפיפטה ואפשרו לדגים לשקוע לתחתית.

גע עם הקצה בתמיסת הקיבוע ואפשר להן לעבור באמצעות כוח הכבידה. הקפד לא לדלל את ה-agro כדי שניתן יהיה להשתמש בו שוב. השלך את שארית תמיסת ההרדמה מהמיקרופיפט.

לאחר מכן, באמצעות אותה טיפ, העבירו את הדג לצלחת פטרי. בערך 30 µL של תמיסת קיבוע, כווןו בעדינות את הדג כך שהאזור המעניין יהיה ממורכז בטיפת ה-aeros. ודאו שהדג נשאר בכיוון הרצוי עד שה-aeros מתמצק.

ניתן לקבע מספר דגים בצלחת פטרי אחת במידת הצורך. לאחר שהאירוסול התמצק, העבירו את הדגים לבמה של מיקרוסקופ הקונפוקלי והוסיפו בעדינות לצלחת תווך דגישה המכיל trica פלוס או מינוס PTU עד שהדגים שקועים לחלוטין. פתחו את תוכנת הדימות והתמקדו באזור העניין כדי להשיג דימות אופטימלי של פרטים תאיים ו/או מולקולריים.

השתמשו בעדשות עם מרחק עבודה ארוך וממספרים נומריים גבוהים בתוכנה. בחרו את הגדרות הפלואורסצנציה המתאימות מרשימת הבחירה. לחצו על הגדרות הספקטרום ובצעו התאמות לטווחי הפליטה.

כדי להשיג הפרדה נקייה של אותות הדגימה (reporter signals) ולמקסם את יחסי אות לרעש, יש לבחור את העדשה המתאימה מהתפריט הנפתח כדי להבטיח שכל הגדרות המערכת (presets) שהוגדרו בתוכנה יותאמו כראוי. כדי למקד את הלייזרים ולקבוע את רמות ההספק, יש לבחור פלט מטבלת הערכים (lookup table) שחושף רוויית פיקסלים (pixel saturation) עבור כל ערוץ.

בשלב הבא, הגדירו את רגישות הגלאי כדי להשיג את איכות התמונה הרצויה, והעלו בהדרגה את הספק הלייזר עד שעוצמת התמונה תהיה מקובלת. הימנעו מרוויית פיקסלים (pixel saturation) באזור העניין ושמרו על רמות לייזר נמוכות ככל האפשר, כדי להפחית בעיות של פוטובליצ'ינג (photobleaching) ופוטוטוקסיות.

יש לוודא שכל קו לייזר מייצר אות ניתן לגילוי אך ורק בערוץ המתאים, על ידי הדלקה וכיבוי ידנית של הלייזרים תוך ניטור של כל ערוצי הדמיון. אם לא נצפה crosstalk, ניתן לרכוש את כל הערוצים בו-זמנית. לאחר מכן, יש למסגר את אזור העניין באמצעות פונקציות הזום והסיבוב.

לאחר מכן, הגדירו את מהירות הסריקה ואת גודל התמונה; שימוש במהירויות סריקה גבוהות יותר מקצר את זמן השהייה של הלייזר ומגביר את הרזולוציה הטמפורלית. הגדירו את גודל הצעד בממד Z בהתאם לצרכים הניסיוניים. במקרה זה, נעשה שימוש בגודל צעד של 10 microns כדי לדמות שבעה חתכים אופטיים של רקמת רשתית.

לאחר שנקבעו ההגדרות המתאימות, רכשו תמונות Zack ושמרו אותן. לאחר מכן עברו לדג הבא. ניתן לבצע דימוג רצף של לכידה ושחרור כדי לעקוב אחר שינויים תאיים לאורך ימים עוקבים, בהתאם להוראות במסמך הכתוב המצורף.

בעת ביצוע ניסוי דימוי רב-סמנים (multi reporter), מומלץ להשתמש בفلואוריפורים המופרדים היטב ספקטרלית, אך הדבר אינו תמיד מעשי. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה להפחתת תמונות (image subtraction) באמצעות התוכנה בקוד פתוח ImageJ, כדי להפריד בין פלואוריפורים בעלי פרופילי עירור ופליטה חופפים. במקרה שלנו, GFP ו-YFP.

טכניקות הדימוי לאורך זמן המתוארות בסרטון זה שימשו למעקב אחר תאי גזע רטינליים המסומנים ב-GFP במהלך אבלציה ורגנרציה של נוירונים ביפולריים ברשתית. כדי לבצע הפרדה ספקטרלית, אספו תמונות באמצעות מצבי דימוי רצפיים והגדרות משתנות של מסנני מחסום, המאפשרות רכישה עצמאית של פלואורופורים חופפים והפרדה חלקית שלהם, בהתאמה. לאחר רכישת התמונות, השתמשו בייבוא ה-loci bio formas ב-ImageJ כדי לפתוח את קבצי התמונה ולהפעיל את כלי הייבוא. גררו את הקובץ הרלוונטי אל חלון ה-ImageJ.

פצל את הערוצים למערכות תמונות (stacks) בודדות באמצעות תיבת הסימון split channels בחלון הייבוא כדי להתחיל בתוסף align three TP. לחץ על plugins, ולאחר מכן על align stacks, ואז על align three tp.

יש ליישר את הערימות כדי להבטיח חיסור תקין. בחר את ערימת הייחוס בתיבת הבחירה הראשונה ואת הערימה שאינה מיושרת בשנייה. סמן את תיבות use XY relative origin ו-use Z relative origin ולחץ על אישור.

כדי להתחיל בתהליך היישור, לחצו על כפתור רישום הנפחים (volume registration). ייפתח חלון חדש המכיל את פרמטרי היישור. לחצו על אישור.

סעיף זה עבר אופטימיזציה על ידי מפיץ התוסף, ולכן אין צורך בביצוע שינויים. עם הסיום, יופיע חלון של ערימות מיושרות (aligned stacks). בחר את הפלט מהחלון המיושר כדי לפתוח את חלון הפלט.

חלון זה מותאם גם הוא ואינו דורש שינוי. לחץ על אישור (okay). ערימה חדשה תופיע במרחב העבודה עם המילה aligned המתווספת לסוף כותרת הקובץ.

כדי להסיר crosstalk באמצעות מחשבון תמונות (image calculator), לחצו על process ולאחר מכן על image calculator. בחרו בתפריט הנפתח של image one את הערימה (stack) שיש להפחית ממנה, ובתפריט הנפתח של image two את הערימה שתשמש להפחתה. בחרו subtract בתפריט הנפתח של operation ולחצו על okay.

Image J יבקש לעבד את הערימה (stack). בחר כן. ערימה חדשה אמורה להופיע, שבה הוסר ה-crosstalk בין הערוצים החופפים.

מזגו את הערימות כדי לשחזר את מבנה התמונה המקורי לפני היישור וההפחתה. על ידי בחירת הערוצים הממוזגים בחלון כלי הערוצים, מאפשר הכלי מיזוג של עד ארבע ערימות להיפר-ערימה (hyper stack). לבסוף, צבעו את הערוצים, כוונות את הבהירות והניגודיות ושמרו את הקבצים כ-tiffs כדי לבחון את האובדן וההתחדשות המכוונים של nitro reductase.

תאי ביפולרטים רטינליים המבטאים M cherry. סדרת תמונות קונפוקאליות צולמו בדגי zebrafish בודדים לפני הטיפול. קיימת ביטוי פסיפס של YFP reporter המסומן לממברנה בתאי ביפולרטים בקרה, המוצגים בצהוב, וחלבון איחוי של nitro reductase ו-cherry בתאי ביפולרטים ממוקדים, המוצגים באדום.

הטרנסגן CFP המסומן בממברנה ומוצג בצבע ציאן מספק מידע הקשרי על מרבית תאי הרשתית האחרים לצורך בהירות נוספת. אותה תמונה ללא אות ה-CFP מוצגת לאחר טיפול ב-metronidazole. התאים הבי-פולריים המבטאים nitro reductase בצבע אדום אובדים, בעוד התאים הבי-פולריים של קבוצת הביקורת בצבע צהוב נשמרים.

דבר זה מדגים את אופייה הספציפי מאוד של מתודולוגיית האבלאציה הזו. שוב, אותה תמונה ללא CFP מוצגת לצורך בהירות. כאשר metro NIAZ מוסר, תאים המבטאים NTR חוזרים לכאן.

דוגמה לשיטת ההחסרה G-F-P-Y-F-P מוצגת באיור זה של תאי Mueller המסומנים ב-GFP. תאי GL מוצגים בירוק ותאי bipolar המסומנים ב-YFP מוצגים בסגול. חפיפה בין השניים יוצרת צבע לבן לצורך ביצוע ההחסרה.

ראשית יש לבצע יישור (alignment) של תמונות ה-GFP וה-YFP. תהליך החסירה מאפשר להסיר מהתמונת GFP תאי ביפולריים המסומנים ב-YFP, ובכך להציג בצורה נקייה את תאי ה-Mueller המסומנים ב-GFP ולאתר תאי Mueller עמומים יותר. כעת ניתן לאמת את החפיפה בין תאי Mueller עמומים לבין תאי ביפולריים המסומנים ב-M cherry המוצגים בצבע אדום.

הנתונים המוצגים כאן מרמזים כי אבלציה של תאי ביפולרית מעוררת את תאי המולר להחליף את התאים שאבדו. פרשנות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים עדכניים על רגנרציה של הרשתית, המצביעים על תאי מולר כפרוגניטורים המושרים על ידי פגיעה, הן ביונקים והן בדגים. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מנגנונים המווסתים רגנרציה של סוגי תאים ספציפיים באמצעות ויזואליזציה של תאי גזע בדגי זברה.