Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers
6 במרץ 2009
הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.
ובכן, מה שבאמת ייחודי בבדיקת ה-Teer הוא שהיא מאפשרת לדמיין באופן ישיר תאי T ספציפיים לאנטיגן. ה-te, ה-teer הוא ההיבט הייחודי המרכזי של הבדיקה שלנו. דבר זה משולב עם שלב הגברה שאנו מבצעים.
אתם יודעים, אנו מבודדים את תאי ה-T ולאחר מכן מגדלים אותם בסביבה המעשירה את הדגימה בתאי ה-T שמעניינים אותנו. לאחר מכן, אנו מסוגלים לסמן באופן ספציפי רק את אותם התאים ולהדמות אותם במכשיר flow cytometer. ובכך, במדידות קודמות, כמו CFSE או בדיקות פroliferation שהיו קיימות במשך עשורים, מה שקיבלתם היה מעין מדידה כוללת של המצב של כל써 אוכלוסיית תאי ה-T.
אך ישנם מיליוני תאי T בגוף והם מזהים קשת מגוונת של תבניות. אם תהיו ברי מזל, אולי אחד מכל 200,000 עד 300,000 תאים בדגימה יהיה התא שאתם מחפשים. זו הסיבה שבדיקה זו כוללת את שלבי ההעשרה.
ולכן, עם מספר בדיקה מסוים, ומכיוון שמדובר בצביעה ישירה, ניתן למעשה להבחין, מעבר לרקע, באוכלוסייה המהווה פחות מ-1% מכלל התאים. כך ניתן לזהות הבדלים קטנים מאוד ולהגיע לספירה מדויקת למדי של מספר תאי ה-T שבדגימת הדם, כלומר, אלו שבאותו הפרט המזהים את התבנית המבוקשת. אך זה לא נגמר שם, שכן ה-tetramers מאפשרים לא רק לסמן את תאי ה-T הללו, אלא גם לבודד אותם לצורך ניתוח המשכי.
והטטרים שאתם משתמשים בהם מיוצרים למעשה כאן ב-BRI, זה נכון? כן. אנחנו אחת מקומץ קטן של מעבדות במדינה שהצליחו לייצר טטרים מסוג class two. כוונתנו היא להפיץ את הריאגנטים הללו במחיר עלות לכל המעבדות שמעוניינות לייבא את הטכנולוגיה הזו.
מה לדעתך הם ההיבטים הקשים או המאתגרים ביותר של הבדיקה הזו כשמדובר בשחזור שלה במעבדות אחרות? ובכן, כשאני חושב על כך, ישנם למעשה שניים, גידול תאי ה-T. זהו משהו שהוא באמת מעט כמו אמנות.
אתה מקבל החלטות כמעט מדי יום לגבי השאלה האם התאים זקוקים לרכיבי תזונה נוספים או למרחב גדילה נוסף. ולאחר מכן, החלק השני, שלדעתי הוא ככל הנראה הקשה ביותר עבור מפעיל חסר ניסיון, הוא למעשה ניתוח הנתונים. סוג של הבנה איזה חלק מהאות הוא באמת תגובה חיובית, לעומת איזה חלק נובע פשוט מפיזיקה וממשיכה.
והעובדה שלכל דבר יש מידה מסוימת של דביקות היא עניין שדורש שוב ניסיון רב, במיוחד בהקשרים שבהם התגובה הכוללת צפויה להיות חלשה מעט. כיצד המידע שייווצר באמצעות בדיקה זו עשוי להועיל למטופלים בשלב זה? אחד הסימנים הראשונים המופיעים אצל כל מטופל עם מחלה אוטואימונית הוא מעין קבוצה של נוגדנים הספציפיים לאותה מחלה.
אנו יודעים מיסודות האימונולוגיה שבכל מקום שבו קיימת תגובת נוגדנים, תמיד קיימת תחילה תגובה של תאי T. לכן, אם נשכיל לבחון אנשים הנמצאים בסיכון ולזהות את הזינוק בפעילות תאי T הקודם להיווצרות נוגדנים, הדבר יעזור לנו להגדיר רמה חדשה של סיכון עבור אנשים הפונים לפיתוח נוגדנים עצמיים, מה שסביר שיפתח חלון להתווכויות טיפוליות. פרוצדורה זו תטהר ותרחיב תאי T חיוביים ל-CD4 הספציפיים לאנטיגן, ותדגים אותם באמצעות ריאגנטים וציוד של teters במכסורות זרימה למינרית (laminar flow) בדרגת בטיחות ביולוגית 2.
זה יהיה מרחב העבודה הראשי עבור הפרוצדורה. מבחנות קוניות של 50 מיליליטר, מבחנה ראשית לבידוד PBMC, אחד XPBS. זה צריך להיות נקי מסידן ומגנזיום, עטוף בנייר אלומיניום להגנה מאור, מכשיר עזר לפיפטה (pipette aid), פיפטות CoStar 10 מ"ל, מכלים עם רכיבי סינון של 50 מ"ל למניעת זיהום דם של הצנטריפוגה.
פיפטות העברה של סנטריפוגה GS six R, פיפטות פסטור, בופר המוליטי המכיל 8.3 גרם לליטר של כלוריד amonium, 1.0 גרם לליטר של נתרן ביקרבונט, 0.04 גרם לליטר של DI sodium EDTA, תמיסת trian blue בריכוז 0.2% ב-PBS, hemo CYTOMETER, מבחנה קונית של 15 מיליליטר, בופר הרצה המכיל PBS מועשר ב-2 מילימולר EDTA פלוס 5 גרם לליטר.
ערכת בידוד BSA max CD four שנרכשה מ-Milin biotech, בלוק מגנטים EP שנרכש מ-stem cell technologies. ניתן להשתמש בפלטפורמות אחרות להעשרה מגנטית של תאים ביעילות שווה. מבחנת פוליפרופילן בנפח 5 milliliter, מצע RPMI 1640 מועשר ב-25 millimolar hippies להכנת מצע לתאי T, סרום אנושי מאוחד לתוספת למצע תאי T, pen strip לתוספת למצע תאי T, מסנן בקבוק בנפח 500 milliliters עם נקבים של 0.22 micron, פלטת 48 בארות סטרילית המשמשת לתרבית הרחבה in vitro, אינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 degree, תמיסה בריכוז 20 milligram per milliliter של פפטיד סינתטי המכיל את האפיטופ הרלוונטי.
נפח של 5 מיליליטר של מבחנת פוליסטירן מסוג fax tube עם מטען פפטידים מסוג class two teer שימשה להדמיה של תאי T ספציפיים לאנטיגן; נוגדנים מסוג anti CD three, anti CD four ו-anti CD 25 שימשו לציפוי תאי T ספציפיים לאנטיגן. מערך flow cytometer מסוג Fax caliber או מקבילו. לפני תחילת הפרוצדורה, רכזו את כל החומרים והציוד בסביבת העבודה.
ההדגמה הבאה תכסה את השלבים הבאים: בידוד PBMC, הפרדת תאי T חיוביים ל-CD4, תרבית הרחבה in vitro, והדמיות של תאי T באמצעות צביעה או זרימה (flow cytometry). שלב אחד: בידוד PBMC.
יש להשיג דגימת דם. את הדם יש לאסוף למזרקים או למבחנות דם ולהוסיף הפרין כמנוגד קרישה ביחס של 1:50 כדי למנוע קרישה; צפו לתשואה של כמיליון PBMC למיליליטר דם, כאשר כ-40% מהם יהיו תאי T חיוביים ל-CD4.
חלקו את הדם למבחנות קוניות של 50 milliliters. 25 milliliters של דם לכל מבחנה. ערבבו בעדינות את הדם לפני קרישה של ALI כדי לפזר את הפלזמה.
הוסיפו PBS עד להגעה לנפח כולל של 40 milliliters וצרו שכבה תחתונה על ידי ייבוש של 11 milliliters של בקבוקון המוכנס לתוך מבחנה דם, תוך הסרה זהירה של עזר הצומèt מהפיפט. נוזל הבקבוקון יזלג לאט לתחתית המבחנה. לאחר שהמפלסים השתוו, הוציאו לאט את הפיפט ממבחנת הדם, סגרו את המבחנות במכסים והעבירו אותן לסלי מיגנוע (aerosol canisters).
סגרו את המכלים היטב וסבבו בצנטריפוגה ב-900 ×g למשך 20 דקות ללא בלימה. קריטי שלא תבוצע בלימה בסיום סבוב זה, שכן כוח הבלימה ישבש את שכבת התאים לאחר הסבוב. ה-pbmc אמורים ליצור שכבה לבנה מובחנת בין הפלזמה הצהובה שמעליה לבין השכבה השקופה שמתחתיה.
הסיר בעדינות את שכבת תאי הדם הלבנים באמצעות פיפט העברה והעבר אותה למבחנה חדשה. ייתכן שחלק מהפלסמה והפיאל יישאבו יחד עם ה-pbmc, אך הימנע משאיבה של שכבת תאי הדם האדומים. בדרך כלל ניתן לאחד שתי מבחנות דם למבחנת תאים אחת בשלב זה.
כדי להגדיל את גודל המשקע, הוסיפו PBS עד לנפח כולל של 15 milliliters וסנטריפיגו ב-500 times G למשך 15 דקות עם low break ו-aerosol of canisters. שאבו את הנוזל באמצעות פפית פסטור, תוך הקפדה לא להפריע למשקע. טפלו בבופר המוליטי על ידי הוספה של חמישה עד שישה milliliters לכל מבחנה וערבוב עדין להסרת גושים. דגרו למשך לא יותר מחמש דקות.
הוסיפו PBS עד לנפח כולל של 50 milliliters וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 230 times G למשך 10 דקות. בבלימה איטית כבר אין צורך במיכלי איסוף של אירוסול עבור סיבובים איטיים אלו. שטפו פעמיים על ידי שאיבת הנוזל באמצעות פיפטת פסטור, מילוי המבחנה ב-PBS וסבב בצנטריפוגה במהירות של 230 times G למשך 10 דקות לפני שלב השטיפה הסופי; הסירו מנה (aliquot) של תאים שהושעו, דללו עם tripan blue וספרו באמצעות המוציטומטר.
ספירה זו של התאים תקבע את נפחי הריאגנטים שייעשה בהם שימוש בהפרדת תאי T. בשלב השני, הפרדת תאי T חיוביים ל-CD4, שאבו את הנוזל והוסיפו running buffer כדי להביא את הנפח הכולל ל-40 µL ל-10 מיליון תאים. בדרך כלל הדבר דורש 30 µL של בופר בתוספת נפח המשקע שנותר.
העבר נפח זה לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. הוסף תערובת נוגדנים מערכות הבידוד של CD four, במינון של 10 µL לכל 10 מיליון תאים, סגור את השפופרת והנח על קרח למשך 10 דקות. הוצא את השפופרת מהקרח, הסר את הפקק והוסף 30 µL של running buffer לכל 10 מיליון תאים.
הוסיפו חרו지를 מגנטים מהערכה לבידוד CD4. 20 µL לכל 10 מיליון תאים, סגרו את הפיה והניחו על קרח למשך 15 דקות. הוסיפו 10 נפחים של running buffer לשטיפה וסבבו בצנטריפוגה ב-230 ×g למשך 10 דקות.
במהלך הסבוב, הכין את המגנט ואת מבחנת הפוליפרופילן בנפח חמישה מיליליטר בסביבת העבודה. שאב את הנוזל ממשקע התאים. הוסף two milliliters של running buffer והסר גושים באמצעות פיפטת העברה.
באמצעות אותה פיפטת העברה, העבירו את התאים למבחנה בנפח חמישה מיליליטר והדגירו אותם במגנט למשך 15 דקות. שפכו בזהירות את פראקציית תאי ה-T החיוביים ל-CD4 למבחנה מסומנת של 15 מיליליטר על ידי היפוך המגנט וריקון של כל הנוזל למעט הטיפה האחרונה. הוסיפו שני מיליליטרים נוספים של running buffer למבחנה בנפח חמישה מיליליטר והוציאו אותה מהמגנט.
שטפו בעדינות את ארבעת התאים השליליים מסוג CD off מהדפנות של המבחנה והעבירו אותם למבחנה של 15 mil מסומנת. הוסיפו שני מיליליטר T-cell medium לכל מבחנה. הסירו מנות (aliquots) לספירת תאים וסבבו בצנטריפוגה ב-230 times G למשך 10 דקות.
דללו מנות של תאים עם tripan blue וספרו אותם באמצעות hemo cytometer. ספירות תאים אלו יקבעו את מספר הבארים שישמשו לתרבית ההרחבה. שלב שלוש.
בגידול הרחבה במעבדה (In vitro), שאבו את הנוזל שמעל משקעי התאים החיוביים ל-CD4 והתאים השליליים ל-CD4, בהתבסס על ספירת התאים. הוסיפו מצע גידול לתאים החיוביים ל-CD4 כדי להתאים את הנפח ל-3 מיליון תאים למ"ל. הוסיפו מצע גידול לתאים השליליים ל-CD4 כדי להתאים את הנפח ל-10 מיליון תאים למ"ל.
תרבית ההרחבה דורשת 3 מיליון תאי CD4 שליליים לכל באר ושני עד 3 מיליון תאי CD4 חיוביים לכל באר. בדרך כלל, תאי CD4 חיוביים הם האוכלוסייה המגבילה. חלק את תאי ה-CD4 השליליים למספר הבארים המתאים בלוח בעל 48 בארים.
לאחר הוספת 300 µL לכל באר, מקמימו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. הוציאו את הפלטה מהאינקובטור, שטפו את הבארות על ידי הוספת 500 µL של מצע טרי, ביצוע שאיבה והזרקה עדינה (pipetting) 12 עד 20 פעמים באמצעות פפית העברה, והסרה של כל הנוזל. שטיפה זו תשאיר שכבה של תאים מציגי אנטיגן (antigen presenting cells) דבקים.
עם השלמת השטיפה, הוסיפו כמות מספיקה של מצע כדי להרטיב את תחתית כל באר, בערך 100 µl. אחרת, התאים הדבקים יתייבשו. במידת הצורך, הוסיפו שני עד שלושה מיליוני תאי CD4 חיוביים לכל באר.
הוסיפו מצע נוסף עד להגעה לנפח כולל של 1 מיליליטר בכל באער. הוסיפו את הפפטיד הרצוי לכל באער. הריכוז הטיפוסי לעידוד הוא 10 מיקרוגרם למילילטר.
לבסוף, הכניסו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שבעה ימים. לאחר שבעה ימים, הוסיפו 50 µL של hemo IL two לכל באר בכל יום שלאחר מכן.
עקבו אחר צמיחת התאים באמצעות מיקרוסקופ. בבארים שטרם הגיעו להסנפיגנציה (confluency), הסירו מחצית מהמדיה, הוסיפו מדיה רעננה ו-50 microliters של IL-2. בבארים שהגיעו להסנפיגנציה, בצעו פיצול (split) על ידי רספנסיה של התאים והעברה של מחצית מהם לבבוא ריקה. הוסיפו מדיה רעננה ו-50 microliters של IL-2 והחזירו את התאים לאינקובטור. התאים המתרבות יהיו מוכנים לצביעת Teer לאחר 13 עד 15 ימי תרבית.
שלב ארבע, ויזואליזציה של תאי T באמצעות צביעת T-cells, רכשו או הרכיבו טטרומרים התואמים לשילובי הפפטיד וה-MHC ששימשו לעידוד תאי T חיוביים ל-CD4. הוציאו את הפלטה מהאינקובטור.
שאבו בזהירות מחצית מהמדיום מכל באר. העבירו אליקוט של תאים מכל באר, בדרך כלל 75 µL או כ-50,000 תאים, לשפופרת פוליסטירן של 5 mL. הוסיפו תגית (teer), בדרך כלל 1 µL לכל 50 µL מהנפח הכולל, והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. מומלץ להצבע את אליקוט שני מכל באר עם תגית לא תואמת (mismatched teer) כביקורת שלילית. סמנו את התאים באמצעות נוגדנים מסוג anti-CD3, anti-CD4 ו-anti-CD25.
ניתן להשתמש בסממני נוגדנים נוספים או חלופיים. עם זאת, אין להשתמש בנוגדנים המסומנים ב-PE, כיוון שערוץ זה חייב להישאר שמור עבור ה-teems בשלב זה. כמו כן, יש לסמן כל בקרת צבע בודד או בקרת איזוטיפ באמצעות תאים נוספים.
דגרו תאים המסומנים בנוגדנים למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות. שטפו כל מבנה עם 0.5 עד 1 מיליליטר של תמיסת שטיפה (running buffer) וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 230 ×g למשך 10 דקות. שפכו בזהירות את הנוזל מכל מבנה, וכיילו את ציטומטר הזרימה באמצעות חרוזי ייחוס, מבני בקרת צבע בודד, בקרות איזוטייפ וכדומה.
נתחו כל מבחנה באמצעות ציטומטר הזרימה. התאים החיוביים לטטרהמר (tetra positive) צריכים להוות אוכלוסייה נפרדת בקרב תאי T חיוביים ל-CD4 שהורחבו. תאים חיוביים לטטרהמר הם בדרך כלל חיוביים ל-CD25 ולעיתים קרובות הם CD4 high.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
נוהל זה מדגים את הטיהור וההרחבה במקום (in vitro) של תאי T מסוג CD4+ ספציפיים לאנטיגן מדם פריפריאלי שלם, ואת הוויזואליזציה שלהם באמצעות טטראמרים של MHC class II. טטראמרים מאפשרים ויזואליזציה ישירה של תאי T בעלי ספציפיות לאנטיגן בודד והגבלה מוגדרת ל-MHC class II.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של תאי T
- cytometry זרימה (Flow cytometry)
רקע
- תאי T ספציפיים לאנטיגן ממלאים תפקיד מכריע בחסינות נרכשת.
- בדיקות מסורתיות מספקות מדידות כוללות של אוכלוסיות תאי T.
- ויזואליזציה ישירה של תאי T ספציפיים משפרת את ההבנה של תגובות חיסוניות.
- טטרמרים של MHC class II מאפשרים זיהוי מדויק של תאי T.
מטרת המחקר
- לניקוי ולהרחבה של תאי T מסוג CD4+ ספציפיים לאנטיגן.
- להדמיה של תאי T אלו באמצעות טטרמרים של MHC class II.
- לשיפור שיטות למחקרי תגובות של תאי T.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי T מדם פריפריאלי.
- הרחבה במעבדה (In vitro) של תאי CD4+ T ספציפיים לאנטיגן.
- סימון תאי T באמצעות טטראמרים של MHC class II.
- הדמיה של תאי T מסומנים באמצעות ציטומטריית זרימה.
תוצאות עיקריות
- טיהור מוצלח של תאי T מסוג CD4+ ספציפיים לאנטיגן.
- הרחבה יעילה in vitro של אוכלוסיות תאי T מטרות.
- ויזואליזציה ברורה של תאי T באמצעות טטראמרים של MHC class II.
- ספציפיות משופרת בזיהוי תגובות של תאי T.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר מדויק של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- טכניקות ויזואליזציה משפרות את ההבנה של מנגנונים חיסוניים.
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרים אימוןולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
ויזואליזציה ישירה של תאי T מסוג CD4+ ספציפיים לאנטיגן מאפשרת בחינה מדויקת של תגובות חיסוניות בהקשרים של מחלות אוטואימוניות ומחלות זיהומיות. שיטה זו תומכת בתיקוף של מטרות (target validation) על ידי קישור הספציפיות של תאי ה-T למנגנוני המחלה, ובכך מספקת ביטחון תחזיתי לפיתוח ביומרקרים ולהתזמון של התערבויות טיפוליות. אסטרטגיית ההגברה והצביעה של הבדיקה מאפשרת זיהוי של אוכלוסיות נדירות של תאי T, ובכך מסייעת להערכת רמות סיכון בקוהורטות פרה-קליניות וקליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של תאי T ספציפיים לאנטיגנים רלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על התרחבות תאי T המונעת על ידי אנטיגנים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי פעילות מוקדמת של תאי T הקודמת להיווצרות נוגדנים עצמיים באנשים הנמצאים בסיכון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות, המתאימות לניתוח בציטומטריה של זרימה, של תדירות תאי T ספציפיים לאנטיגן לאחר הרחבה in vitro.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זיהוי תתי-אוכלוסיות נדירות של תאי T באמצעות העשרה וצביעת טטראמרים, ובכך משפר את השחזוריות של הבדיקה.
- תועלת הפלטפורמה: מאפשרת סריקה של אינטראקציות פפטיד-MHC לצורך הערכת אימונוגניות בפיתוח חיסונים ותרופות ביולוגיות.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מקל על התאמה של ביומרקרים תרגומיים על ידי הקשר בין רמות של תאי T חיוביים לטטראמר לבין סיכון למחלה או התקדמותה.
- ערך תפעולי: תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למעקב אורכי של תגובות ספציפיות לאנטיגן.
- הפחתת סיכונים: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים המתווכים על ידי תאי T.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, ותומכת בבדיקת השערות בביולוגיה בסיסית, במוכנות של בדיקות (assay) לסריקות, ובקריאות מכניסטיות במחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות באמצעות בידוד והדמיה של תאי T המגיבים לפפטידים אנטיגניים ספציפיים.
- סריקה: מספקת מוכנות למדידה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להרחבה ולצביעה, המניבים תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מבוססות ציטומטריה של זרימה של תאים חיוביים לטטראמר, המאפשרות השוואה בין תנאים ותורמים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניטור אורך של דינמיקת תאי T ספציפיים לאנטיגן הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה אימונולוגית לשימוש חוזר להערכת ספציפיות לאנטיגן בתחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי של תיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתגובות חיסוניות המונעות על ידי תאי T.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות אסטרטגיות מוגדרות להתרחבות, צביעה ו-gating.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אפשור גילוי מוקדם של פעילות פתוגנית של תאי T, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי מועמדים אימונוגניים בהתבסס על דיוק התגובה של תאי T.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונולוגיה, תרביות תאים ופירוש נתוני ציטומטריית זרימה.
- תלוי בגישה לריאגנטים של טטראמרים מסוג peptide-MHC, אינקובטורים, כלים להפרדה מגנטית ומכשירי ציטומטריית זרימה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של בקרות צביעה, כולל השוואות לטטראמרים לא רלוונטיים, כדי לנהל את השונות ברקע.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום לסוגי HLA שונים, זיקות של פפטידים או תתי-אוכלוסיות של תאי T.
- מוגבל בשל האתגר הטכני של שמירה על התרחבות עקבית של תאי T והבחנה בין אות אמיתי לצביעה לא ספציפית באוכלוסיות בעלות שכיחות נמוכה.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:09
Introduction
3:21
Reagents and Equipment
5:44
Assemble Materials and Equipment at Workspace
6:04
Step 1: PBMC Isolation
8:51
Step 2: CD4+ Cell Separatioin
11:01
Step 3: In Vitro Expansion Culture
13:34
Step 4: Visualizing T Cells by Tetramer Staining
15:33
Conclusion
1:05
T Cell Staining
