טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו
13 באוגוסט 2009
טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.
על ידי שילוב של היברידיזציה in situ וצביעת טטראמר בטכניקה המכונה ISTH, ניתן לקבוע את המספרים היחסיים והקשרים המרחביים בין תאי אפקטור חיסוניים ספציפיים לאנטיגן ויראלי לבין תאים ורקמות נגועים בווירוס. תהליך ה-ISTH מתחיל בהטמעה של רקמה טרייה נגועה ב-SIV בתוך agarose. הרקמה נחתכת לפרוסות בעובי 200 micron באמצעות vibratome ונצבעת לאיתור אנטיגן ויראלי.
תאים ספציפיים מסוג CD8+ באמצעות MHC tetramers המסומנים ב-fit C. לאחר הקפאה, נתחים צבועים אלה נחתכים הלאה לחתכים בעובי של 8 µm באמצעות קריוסטט, ומבוצעת היברידיזציה in situ כדי לאתר תאים שנדבקו בנגיף. מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לדמיון של הנתחים עם הכביעה הכפולה ובסופו של דבר לשחזור הנתחים העבים המקוריים כדי לחשוף את הקשר בין התאים האפקטוריים החסוניים לתאי המטרה.
שימוש בנוהל זה לבחינת זיהום SIV מוקדם הוכח כגורם ניבוי טוב לחומרת המחלה שתבוא לאחר מכן. שלום, אני Chinen Lee מהמעבדה של Ashley HA במחלקה למיקרוביולוגיה באוניברסיטת מינסוטה. אני Pam Skinner, מרצה במחלקה למדעי הביו-וטרינריה באוניברסיטת מינסוטה.
היום נדגים לכם פרוצדורה של היברידיזציה במקום, או ISTH בקיצור. בנוסף לשימוש בצביעת טטראמר במקום בשילוב עם היברידיזציה במקום, כפי שנדגים היום, אנו משתמשים באופן שגרתי בצביעת טטראמר במקום בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את המיקום, השכיחות ופרופיל ביטוי החלבון של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן in situ. יעזרו לנו היום בצביעת הטטראמר במקום בחתכים עבים ד"ר Heon Kim ו-Terry Matala, ויעזרו לנו בהכנת חתכים דקים ובהיברידיזציה במקום So. בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, קררו את אמבט ה-Vibram המכיל PBSH סטרילי לטמפרטורה של 2°C. הגדירו את זווית להב הרטט ל-27 מעלות. במידת האפשר, שמרו רקמות טריות מקוררות על קרח והתחילו את ההליך תוך 24 שעות לאחר קצירת הרקמות.
על מנת למזער פירוק עקב קירור, המיקרוטום גם מקל על חיתוך רקמה טרייה; יש להסיר רקמה חיבורית ולחתוך את הדגימה בעזרת סקלפל לחתיכות קטנות, להניח את החתיכות ב-whey boat ולכסות ב-4% low melt agarose ב-PBS שהומס בטמפרטורה של כ-40 °C. ודאו שהרקמה באה במגע עם תחתית הצלחת, והדחפו למטה חתיכות רקמה אם הן צפות; יש להקשיר על קרח למשך שלוש עד חמש דקות.
כאן נעשה שימוש ברקמת טחול, אך ניתן להשתמש גם בקשרי לימפה, נרתיק, צוואר הרחם, רחם או רקמות טריות אחרות באמצעות סקלפל. חתכו את ה-agros מסביב לרקמה והעבירו בזהירות באמצעות פינצטה את הרקמה המוטמעת ב-agros אל בלוק הרקמה. המשיכו בציפוי של בלוק רקמה מסוג Vibram בדבק Loctite.
אין להזיז את פיסת הרקמה לאחר הנחתה על בלוק הרקמה. יש להניח לה להתייבש למשך כ-10 דקות על קרח. לאחר מכן, יש להרכיב את בלוק הרקמה במיקרוטום המרטט (vibrator) ולחתוך את הרקמה לחתכים בעובי 200 µm, תוך שימוש במהירות קידום נמוכה מאוד ובאמפליטודה גבוהה יחסית.
השתמשו במברשת צבע כדי להעביר את החתכים הגזורים אל תוך תא רקמה ייעודי הממוקם בבאר של פלטת תרבית רקמה בעלת 24 בארות, הממולאת מראש ב-1 mL של PBSH מקורר. הניחו עד ארבעה חתכי רקמה בכל תא רקמה. סמנו את הדגימות והדקו את המכסה לפלטה באמצעות גומייה על מנת לצבוע את חתכי הרקמה לתאי T ספציפיים לנגיף.
ראשית, מדללים טטרמרים מצומדים ל-ZI בבופר חסימה לריכוז של 0.5 micrograms per milliliter. מעבירים את התמיסה בפיפט לצלחת 24 בארות בנפח של one milliliter לכל בארה. את הרקמה שחתוכה טרי מעבירים לצלחת אל תוך תאי הרקמה, ומניחים לה להתנדנד למשך לילה בטמפרטורה של four degrees Celsius.
השאירו באר ריקה בין תאי הרקמה המכילים דגימות שונות כדי למנוע זיהום צולב של התמיסות בשלבים הבאים. בשלב זה ניתן להוסיף נוגדנים המכוונים נגד חלבונים חוץ-תאיים או חלבונים על פני השטח של התא. לצורך שטיפה, הכינו פלטת תרבית רקמה של 24 בארות המכילה PBSH מקורר לאחר האינקובציה הראשונית.
שטפו פעמיים על ידי העברת תאי הרקמה לפלטה מלאה מראש למשך 20 דקות בכל פעם; ודאו שאתם מנקזים את רוב הנוזל מתאי הרקמה לפני ההעברה. כמו כן, היזהרו שלא לטפטף תוכן של דגימה אחת לתוך דגימה אחרת בעת העברת תאי הרקמה, ועקבו אחר הנגדים בתאי הרקמה כדי לוודא שהם אינם נדבקים לדפנות. קיבעו את הנגדים ב-4%paraldehyde טרי ב-PBS למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר הקיבוע.
שטוף פעמיים ב-PBSH קר למשך חמש דקות בכל פעם כדי להגביר את האות מהטטרמרים. הדגר את החתכים עם נוגדני rabbit anti fitzy ביחס של 1:10,000 בבופר חסימה (blocking buffer) למשך יום עד שלושה ימים. בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים נגד אפיתופים תוך-תאיים.
יש לוודא ביצוע פרמיליזציה של התאים וחסימה של אתרים לא ספציפיים לפני הוספת הנוגדן. ייתכן ויהיה נדרש גם שלב של השבת אנטיגן (Antigen retrieval) לאחר הדגירה השנייה הממושכת שנועדה להגביר את האות. שטפו את החתכים ב-PBSH שלוש פעמים, למשך 20 דקות לפחות ועד מספר שעות בכל פעם.
בצע דגירה סופית עם נוגדנים מתאימים המסומנים בפלואורסצנציה. לדוגמה, ניתן להשתמש ב-goat anti rabbit SI three כדי לקשור את הנוגדנים rabbit anti fitzy כדי לגרום לתאים שנסמנו בטטראמר להיראות באדום פלואורסצנטי. אם נעשה שימוש בנוגדנים מעכבר לצביעה נגדית של חלבונים רלוונטיים כגון CD eight כדי להדמיא תאי T קטלניים, ניתן להשתמש ב-goat anti-US Alexa 488 כדי להיקשר לנוגדנים מהעכבר ולגרום לתאים שנסמנו בנוגדנים להיראות בירוק פלואורסצנטי. יש לקבוע את הדילולים של כל נוגדן באופן אמפירי.
דגרו למשך יום אחד עד שלושה ימים; שמרו על חתכי הרקמה מוגנים מאור על ידי עטיפת הפלטות בנייר אלומיניום במהלך דגירה זו ולאחר מכן, כיוון שאור גורם לדעיכת הפלואורסצנציה. לבסוף, קבעו שוב את החתכים כדי להבטיח את קיבוע הטטראמרים והנוגדנים במקומם. שטפו והעבירו למשטח מיקרוסקופ עם גליצרין ג'לטין המכיל 4 mg/mL NP-gallate לאחסון בטמפרטורה של 20°C- עד להכנת חתכים דקים עבור היברידיזציה במקום (in-situ hybridization).
ניתן כעת לנתח את חיתוכי צביעת הטטראמר במקום (in situ tetramer stain) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי, כדי לקבוע את המיקום, השכיחות ותבנית ביטוי החלבון של תאי T חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן. בתמונה המוצגת, חיתוכי רקמת טחול מקוף רזוס (rhesus macaque) שהיה נגוע ב-SIV נצבעו בטטראמרים של gag כדי לסמן תאי T חיוביים ל-CD8 ספציפיים ל-SIV, וכן בנוגדנים ל-CD20 ונוגדנים ל-CD3. מאחר שצביעת נגד (counterstaining) עם נוגדנים תאבד בשלב הבא, חשוב לנתח את הטטראמרים במקום לפני ההמשך.
התחילו את הליך החיתוך הדק על ידי חימום של החתכים בעובי 200 מיקרון בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות על גבי בלוק חימום, כדי להפריד את החתכים העבים מהזכוכית. לאחר שהחתכים הופרדו, הטמיעו אותם ב-OCT על קרח יבש על ידי מילוי תחתית התבנית הפלסטית ב-OCT. לאחר מכן, הניחו את הרקמה מעל ה-OCT וכסו אותה ב-OCT.
השתמשו בקריוסטט כדי לחתוך חתכים בעובי שמונה מיקרון מהחתכים הטמיעים ב-OCT והדביקו את החתכים בעובי שמונה מיקרון לשקופיות סילוזיות. ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס בתוך קופסה אטומה לצורך ביצוע היברידיזציה in situ בהמשך. היברידיזציה in situ סטנדרטית משמשת לזיהוי תאים נגועים בנגיף באמצעות פרובים של rib ספציפיים לנגיף המסומנים ב-S 35.
הפרוצדורה כוללת גם ציפוי של חתכים במיסות עקבות גרעיניות (nuclear track emulsion) והרכבת שקופיות. בתווך Paramount התואם לפלואורסצנציה, נרכשות תמונות קונפוקאליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי BioRad MRC 1000, המצויד בהתקן השתקפות epi tube blue. צביעת הטטראמר ה-in situ ויזואלית באמצעות EPI one 605 עבור הפלואורוכרום האדום של הטטראמר ו-EPI 2 522 DF 32 עבור הפלואורוכרום הירוק של CD8 עבור ההיברידיזציה ה-in situ.
השתמש ב-EPI two blue reflection עבור גרגירי הכסף הנובעים מאות ההיברידיזציה-इन-situ ברדיאו-אוטוגרפים המפותחים. כדי להתחיל ברכישת הדמויות, רכוש את הדמויות מכל סדרה משמאל לימין ומלמעלה למטה, וודא שכל דמות נלכדת עם חפיפה של כ-20% עם הדמויות השכנות לה. כדי למנוע פרסומים בתמונת המונטאז' המשוחזרת, נהג כל דמות לפי השורה והעמודה שלה בקובץ Excel.
עם השלמת איסוף הנתונים מהשקופיות, השתמש בתוכנת העזר של המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להשליך תמונות סדרתיות של ציר Z עבור כל ערוץ לתמונה אחת באמצעות פרוצדורת פעולה של Photoshop 7 הזמינה מהמחברים, ולמזג באופן אוטומטי את התמונה המוקרנת משלושת הערוצים לתמונת RGB אחת. לאחר מכן, חבר את התמונות הממוזגות יחד בשכבות כדי ליצור תמונת מונטאז' של החתך השלם. שייך גרגרי כסף בודדים וצביעת טטרמר לתאים במונטאז' באמצעות metamorph או Photoshop.
הקצו את קואורדינטות ה-XY של המרכזים או ה-OIDs של התאים החיוביים ל-viral RNA והתאים החיוביים לטטראמר. ייצאו את נתוני ה-OID לקבצי Excel כמספרים נומריים עבור כל תא, והשתמשו בנתונים שנאספו בקבצי ה-Excel כדי לקבוע את היחסים בין תאי אפקטור חיסוניים (תאי e) לבין מטרות ויראליות (תאי T), על בסיס המספרים הכוללים של התאים החיוביים לטטראמר והתאים החיוביים ל-viral RNA בחתך, כדי לתעד את הקשרים המרחביים בין התאים החיוביים לטטראמר לתאים החיוביים ל-RNA. העתיקו והדביקו את התרשימים המתאימים מקבצי ה-Excel למסמך Photoshop בתוכנת Photoshop.
הפחיתו את השקיפות של שכבה כדי ליישר ולהתאים את קנה המידה של הרשתות כך שיחפפו בצבע, בחרו אותן, ולאחר מכן העתיקו והדביקו אותן לשכבה חדשה. במיקומים של התאים הכחולים החיוביים ל-RNA, הסִירו את השכבה ששימשה ליישור הרשתות, ואז ייחשפו במימונה של התמונה המאוחדת מיקומי התאים החיוביים לטטראמר והתאים החיוביים ל-RNA ויראלי. באמצעות שיטת ה-ISTH המוצגת כאן, אנו יכולים לעקוב אחר התגובה החיסונית לזיהום ב-SIV בעקבות הזרקה תוך-נרתיקית בפתח כניסה זה ובמרקמות הלימפטיות שאליהן מתפשט הזיהום.
באתרי רקמה אלו קיימים מספרים גדולים של תאים נגועים ביום ה-10 לאחר ההדבקה, אך גם שלושה ימים מאוחר יותר, קיימים תאים צבועים בירוק החיוביים ל-CD A, אך עדיין אין תאים צבועים באדום החיוביים לטטראמר ספציפי ל-SIV. התגובה החיסונית היא לפיכך מאוחרת מדי כדי לסלק את הזיהום.
עם זאת, שלושה שבועות לאחר ההדבקה, נראה בבירור ירידה במספר התאים המודבקים, במיוחד בפתח הכניסה. השתמשנו ב-ISTH כדי להראות כי מידת ההפחתה נמצאה במתאם עם הקרבה המרחבית והמספרים היחסיים של תאי אפקטור חיסוניים חיוביים לטטראמר ביחס לתאי מטרה חיוביים ל-N-S-I-V-R-N-A; אנו מכנים זאת יחס ה-E ל-T in vivo.
ניתן להדמיות בקלות את היחסים המרחביים באמצעות שיטה זו, כאשר תאי אפקטור מופיעים באדום ומטרות ויראליות בכחול בבלוטת הלימפה הזו שנדבקה. תאי אפקטור ותאי מטרה רבים נמצאים בקרבה הדדית, וישנם אזורים שבהם תאי אפקטור רבים מקיפים תא בודד חיובי ל-S-I-V-R-N-A, בעוד שבאזורים אחרים תא חיובי ל-S-I-V-R-N-A עומד לבדו. יחס ה-ETT מחושב פשוט על ידי קביעת מיקומי התאים ותיעודם לפי מספרם של כל אחד מהם בקובץ ה-Excel.
השליטה הטובה ביותר בזיהום הנגיפי נמצאת במתאם עם עודף משמעותי של אפקטורים באדום ביחס למטרות בירוק, ביחס של 43 לאחד. במקרה זה, בצוואר הרחם ובנרתיק שבהם התחיל הזיהום, יחסי ETT היו נמוכים יותר בקשרי הלימפה. המתאם החיובי בין יחסי ETT גבוהים לבין הפחתה בעומס הנגיפי משיאו מעיד על כך שתגובה חיסונית חזקה יותר בפתח הכניסה מתרגמת לשליטה טובה יותר בזיהום.
הרגע הצגנו בפניכם כיצד לזהות בו-זמנית תאי CDAT ספציפיים מאוד ותאי זיהום נגיפיים in situ. טכניקה זו מאפשרת לנו להדמיות בו-זמנית תאי T ספציפיים לאנטיגן ותאים נגועים בנגיף ברקמות. ניתן ליישם טכניקה זו להערכת חיסונים המבוססים על תאי T חיוביים ל-CD8, וכן לאינטראקציות אחרות בין פתוגנים למארח שאינן קשורות לחיסון בעת ביצוע פרוצדורה זו.
חשוב לשמור על כל הריאגנטים נקיים מ-RNA לפני ביצוע ההיברידיזציה. זהו כל התהליך. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה הנקראת צביעת טטראמר in situ בשילוב עם היברידיזציה in situ (ISTH) לצורך ניתוח הקשרים המרחביים בין תאי T מסוג CD8+ ספציפיים לנגיף לבין מטרותיהם. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ומיפוי של תגובות חיסוניות ברקמות שנדבקו בנגיפים, ובכך מספקת תובנות לגבי תוצאות הזיהום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- וירולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת האינטראקציה בין תאי מערכת החיסון לבין תאים נגועים בנגיף היא קריטית לפיתוח טיפולים יעילים.
- תאי CD8+ T ממלאים תפקיד משמעותי בבקרה על זיהומים נגיפיים.
- טכניקות נוכחיות לחקר אינטראקציות אלו סובלות לעיתים קרובות מחסור ברזולוציה מרחבית.
- שיטת ISTH משלבת שתי שיטות צביעה כדי לשפר את הוויזואליזציה של אינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להדמיה של קרבתם של תאי CD8+ T לתאים נגועים בנגיף.
- כימות הקשרים בין האפקטורים החיסוניים למטרותיהם.
- הערכת ההשלכות של קשרים אלו על תוצאות הזיהום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הטמעה של רקמה טרייה מזוהמת ב-SIV באגרוזה.
- חיתוך הרקמה לפרוסות לצורך צביעה.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לדמיון של הפרוסות הצבועות.
- שחזור של הפרוסות העבות המקוריות לניתוח אינטראקציות בין תאים.
תוצאות עיקריות
- שיטת ISTH מאפשרת ויזואליזציה יעילה של מערכות היחסים המרחביות בין תאי CD8+ T לתאים נגועים בנגיף.
- הטכניקה מספקת נתונים כמותיים על תגובות חיסוניות.
- הממצאים מעידים כי אינטראקציות מוקדמות יכולות לנבא את חומרת המחלה.
- ניתן להתאים את שיטת ISTH לסוגי רקמות שונים מעבר לטחול.
מסקנות
- ISTH הוא כלי בעל ערך לחקר תגובות חיסוניות בזיהומים ויראליים.
- השיטה משפרת את הבנתנו את הדינמיקה של תאי T in situ.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים רחבים יותר על אינטראקציות חיסוניות במחלות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הבנת הדינמיקה המרחבית בין תאי T מסוג CD8+ ספציפיים לנגיף לבין תאי מטרה נגועים היא קריטית להערכת היעילות של אימונותרפיה ולחיזוי תוצאות זיהום. שיטת ה-ISTH מאפשרת הערכה כמותית של יחסי אפקטור-מטרה ושל קרבה מרחבית, ומספקת תובנות מכניסטיות התומכות בתיקוף מטרה (target validation) ובזיהוי מובילים (lead identification) בפיתוח תרופות נוגדות נגיפים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי קישור אינטראקציות חיסוניות מוקדמות למסלול המחלה, ובכך מספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) בשרשראות פיתוח פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של השערות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של מעורבות תאי T ספציפיים לאנטיגן עם תאים נגועים בהקשר רקמתי.
- ערך תפעולי: מספק נתונים כמותיים בעזירה מרחבית על אוכלוסיות של תאי effector חיסוניים להפחתת סיכונים במנגנוני מטרה.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי קורלציה בין יחסי E:T מוקדמים לבין תוצאות של שליטה בזיהום.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של מיקום ושפע של תאי מערכת החיסון לצורך כיול של בדיקות (assay benchmarking).
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של חתכי רקמה מאומתים עבור תהליכי עבודה של דימיון ואנליזה בהמשך.
- מדרגיות: מקלה על שימוש חוזר בפלטפורמה על פני סוגי רקמות ומודלים של זיהום שונים לצורך סריקה השוואתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מגשרת בין תצפיות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על ארכיטקטורת הרקמה ומערכות היחסים התאיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה האם תגובות חיסוניות שנצפו מעורבות באופן פונקציונלי עם המטרות in situ.
- קידום מותאם סיכון: מספקת בסיס להחלטות המבוססות על מדדים חיסוניים מרחביים וכמותיים, ולא רק על מדידות מסה (bulk).
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת ה-ISTH משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני בכך שהיא מאפשרת ניתוח מונחה-השערות של אינטראקציות בין מערכת החיסון למטרה, לאחר זיהוי ראשוני של המולקולה המובילה (lead) אך לפני אישור היעילות במודלים של מחלות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי חשיפת קולוקליזציה מרחבית של אפקטורים ומטרות.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים, המוכנים לבדיקה, של תדירויות והפצה של תאי מערכת החיסון לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק נתוני התפלגות מרחבית ויחסי E:T מדידים המאפשרים השוואה זה לצד זה של תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: שומר על נאמנות היסטולוגית כדי לאפשר רציפות מניתוח ex vivo לאימות in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה מבוססת היסטולוגיה הניתנת לשימוש חוזר לצורך ניטור חיסוני אורך על פני מחקרים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מנגיסטית על ידי קישור ישיר בין ספציפיות של תאי T למעורבות במטרה ברקמה.
- ערך תפעולי: מייצב את עיבוד הרקמות והצביעה לצורך פרופיל חיסוני מרחבי הניתן לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי זיהוי חתימות חיסוניות מוקדמות המנבאות תוצאות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים מותאם-סיכון בהתבסס על מדדי מעורבות חיסונית פונקציונלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה, היברידיזציה באתר (in situ hybridization) ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי בתשתית של קריוסטט, ויברטום ודימות פלואורסצנטי.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להטמעה של רקמה, חיתוך וצביעה עבור כל המשתמשים.
- חייב להביא בחשבון אופטימיזציה ספציפית לרקמה עבור שחזור אנטיגן וחדירת גשושית.
- מוגבל על ידי זמינות הרקמה ושלמות ה-RNA, במיוחד בדגימות ארכיוניות או דגימות שהתפרקו.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:07
Title
1:07
Introduction
2:18
Preparation of Thick Fresh Tissue Sections
5:22
Staining the Thick Sections with Tetramers
10:11
Preparing Thin Sections
12:17
Acquiring Confocal Microscope Images
17:56
Representative Images of Simultaneous Visualization by ISTH of Immune Effectors and Targets in Tissue Sections
19:50
Conclusion
