Antifouling עצמית התאספו monolayers על Microelectrodes עבור ביומולקולות דפוסים

נוהל זה מתחיל בייצור של מיקרו-אלקטרודה על מצע סיליקון. שכבה מونو-מולקולרית (monolayer) המרכיבה את עצמה של פוליאתילן גליקול נוצרת מעל המיקרו-אלקטרודה והמצע כדי למנוע לכלוך (fouling) של מיקרוטובולים. לאחר מכן, מוכנים מיקרוטובולים המסומנים ברודמין.

לבסוף, מיקרוטובולים מוטמעים על גבי האלקטרודות המטופלות באמצעות אלקטרופורזה. שלום, אני ג'ון נואל מהמעבדה של נאנא במחלקה לפיזיקה ומהמעבדה לביומכניקה מולקולרית במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת טקסס A&M. אני ויל פרי טזה מהמחלקה לפיזיקה ומנהל המרכז למדע וטכנולוגיה של סקאל באוניברסיטת טקסס A&M.

אני חואן קוואנג, מנהל מעבדת ביו-מכניקה מולקולרית במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת Texas A&M. היום נדגים לכם הליך לייצור מיקרו-אלקטרודות המצופות בשכבה עצמית-הסגירה (self-assembled monolayer) נגד ספיחה (non-fouling). אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור תנועת מיקרו-צינוריות באמצעות אלקטרופורזה.

אם כן, נתחיל. ראשית, השתמשו במגרעת (scribe) או בחותך פרוסות כדי לחתוך פרוסות סיליקון לחתיכות של 1 סנטימטר על 1.5 סנטימטר לשימוש כתשתיות. כעת נקו את התשתיות על ידי הנחתן בכלי ביקר עם כמות מספקת של אצטון שתכסה אותן, ובצעו סוניקציה למשך חמש דקות מבלי לאפשר לתשתיות להתייבש.

שטוף אותם באצטון טרי ולאחר מכן שטוף אותם מיד שוב באיזופרופנול והשתמש בחנקן כדי לייבש אותם. באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית בטון חיובי או ליטוגרפיה של קרן אלקטרונים, ייצר את מיקרו-אלקטרודות הזהב על המצעים הנקיים. בעת תכנון גיאומטריית התבנית, שמור על קוטר של כל תבנית אלקטרודה מתחת ל-100 מיקרון. כדי להבטיח כיסוי על ידי השכבה המונחית-עצמית של polyethylene glycol trimeth oxy seline או peg Sam, כלול פדי מגע הממוקמים במרחק של 300 עד 500 מיקרומטר מהתבנית, עם קו באורך של מילימטר אחד המחבר בין הפד לאלקטרודה.

לאחר פיתוח התבנית בשכבת הפוטורזיסט, השתמשו בפינצטה כדי לשרוט קו ברזיסט מהמגע החשמלי (contact pad) ועד לקצה המצע. בעת שיקוע המתכת, השריטה תאפשר מגע חשמלי בין האלקטרודה לקצה המצע. לשם שיקוע שכבת המתכת נעשה שימוש בתא שיקוע, רצוי עם שני מקורות.

האלקטרודות נוצרות על ידי שיקיעה של שני ננומטרים של כרום, ולאחריהם ששה ננומטרים של זהב. ללא שבירת הוואקום, ניתן להשתמש במאזנ בדולל קוורץ (quartz crystal micro balance) המותקן בתוך התא כדי למדוד את עובי השכבות במהלך השיקיעה. כעת ניתן להתחיל בהכנת השכבה המוניקולרית המארגנת את עצמה (self-assembled monolayer) באזור מאוורר היטב; חממו מראש תנור ל-75 degrees Celsius. הכינו את תמיסת הפונקציונליזציה על ידי הוספת מיליליטר אחד של peg seline ל-20 milliliters של טולואן בכלי זכוכית בנפח 250 milliliters.

ערבבו היטב על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) חמישה עד 10 פעמים, ולאחר מכן ערבבו בעזרת הפ pipette למשך 30 שניות. הניחו את דגימות התבנית בתוך הכלי (beaker) כאשר צד התבנית פונה כלפי מעלה, תוך כדי וידוא שהן טבולות לחלוטין בתמיסה ומפוזרות במרווחים שווים על קרקעית הכלי. הניחו את הכלי בתנור ואפו למשך 18 עד 21 שעות בזמן שה-Sam נוצר.

הכינו את אלקטרודת העזר על ידי שיקיע של ננומטר אחד של כרום ולאחריו ארבעה ננומטרים של זהב על כיסוי זכוכית (cover slip) בגודל 22 על 50 מילימטר. אלקטרודת העזר צריכה להיות שקופה כמעט, עם גוון אפור בהיר או ורוד. שמרו את אלקטרודת העזר כשהצד המצופה פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרי כדי לשמור על ניקיונה.

לאחר 18 עד 21 שעות בתנור, הוציאו את הכלי מהתנור. הטולואן אמור להתאדות ולהותיר את דגימות התבנית בשארית צמיגה של peg cline. הוסיפו 20 milliliters של טולואן לכלי והשריו את הדגימות למשך דקה אחת עד שתי דקות.

הוצא את הדגימות מהכלי ושטוף אותן בטולואן, לאחר מכן באיזופרופנול ולבסוף ייבש אותן בזרם חנקן. בשלב זה, הדגימות צריכות להיראות נקיות ושכבת ה-Sam צריכה להיות בלתי נראית לעין. שכבות Sam שהוכנו באופן זה ניתנות לשימוש למשך עד יומיים כאשר הן מאוחסנות בתנאים קרירים ויבשים.

היווצרות לא מוצלחת של SAM גורמת לשכבת שאריות עכורה או בעלת גוון לא אחיד על פני השטח. לאחר הכנת ה-SAMs, נוכל כעת להתחיל בפולימריזציה של טובולין למיקרוטובולות. התחילו בהפשרת טובולין לא מסומן וטובולין מסומן ב-rhodamine, וערבבו אותם מיד ביחס של שניים לאחד של לא מסומן למסומן כדי לקבל מיקרוטובולות בהירות.

ערבבו אותם היטב על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, פולמריזו את ה-tubulin למשך 20 עד 40 דקות באמבט מים מחומם ב-37 °C בזמן שה-tubulin עובר פולימריזציה. הכינו באפר Taxol על ידי ערבוב של 20 µM Taxol עם באפר pipee.

ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים וערבוב במערבל Vortex, ולאחר מכן הניחו את המבחנה בבן-מארח מחומם בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הפולימריזציה, דללו את המיקרוטובוליים בבופר Taxol חמים והגנו עליהם מאור. ודאו שהפולימריזציה של המיקרוטובוליים הצליחה ושהמיקרוטובוליים יציבים תחת עירור פלואורסצנציה למשך מספר דקות.

צלם את המיקרוטובוליים שהוכנו עם תערובת למשיית חמצן, לאחר שהפולימריזציה של הטוביולין למיקרוטובוליים הושלמה. נתחיל כעת בתבנית ה-MTS באמצעות אלקטרופורזה. ראשית, חתוך פס דבק דו-צדדי לרצועות דקות על ידי הנחתו על סלייד זכוכית וחיתוך בעזרת להב תער. הנח שתי רצועות של דבק דו-צדדי לרוחב הדגימה המצופה ב-Sam, כך שהאלקטרודה תהיה בין הרצועות והנתיב המקשר יהיה מאונך לדבק.

הניחו את אלקטרודת העזר על הסרט דו-הדבקי כך שהצד המתכתי נוגע בסרט והקצה של הדגימה בולט מעל אלקטרודת העזר בכשלושה מילימטרים. חתכו מספר קטעים של 15 centimeter של חוט נחושת מבודד למגנטים והסירו סנטימטר אחד מהבידוד משני הקצוות. השתמשו בטיפה קטנה של צבע כסף כדי לחבר חוט לאזור הזהב החשוף של התשתית, תוך הקפדה להימנע מיצירת מגע חשמלי עם אלקטרודת העזר.

כעת השתמשו בצבע כסף כדי לחבר חוט שני למספר (counter). ניתן לחזק את חוטי האלקטרודה המחוברים בצבע כסף לדגימות באמצעות סרט דביק. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, הכניסו מיקרוטובוליים בדילול הרצוי, התבוננו בתמונה בהגדלה של 20x ואתרו את התבנית על פרוסת הסיליקון לפני הפעלת מתח.

בשל עומקו של תא הזרימה, ייתכן שיהיה צורך בעדשות עם מרחק עבודה ארוך כדי לדמיין את פני השטח העליונים של תא הזרימה. המרחק מפני השטח של הדגימה לפני השטח העליונים של תא הזרימה נקבע על ידי עובי הסרט ואמור להיות כ-60 עד 100 micrometers. החל מתח של עד one volt ועקוב אחר נדידת המיקרוטובולין.

אם רצוי לבצע לכידה הפיכה של מיקרוטובוליים, השתמשו בלק גוף כדי לאטום את תא הזרימה למניעת סחיפה צדית, והשתמשו במתחים נמוכים יותר, עד לכ- 0.5 volts. ניתן לעקוב אחר הנדידה על ידי התאמת מישור המיקוד האנכי של המיקרוסקופ; במתחים של כ- 0.9 עד 1.2 volts, המיקרוטובוליים ממוקמים על פני השטחים של האלקטרודות.

מתח גבוה יותר יגרום לנדידה מהירה יותר ולהיצמדות חזקה יותר, אך מתח מופרז יגרום לאלקטרוליזה ולדה-פולימריזציה. מיקרוטובוליים, הראינו לכם כיצד להכין מיקרו-אלקטרודות מצופות SAM לצורך תבנית של MT, מכיוון שציפוי ה-SAM מונע ספיחה של מיקרוטובוליים על גבי המיקרו-אלקטרודות. ניתן להשתמש בהליך זה גם ליצירת תבנית הפיכה של מיקרוטובוליים.

יתרה מכך, תהליך זה אינו מוגבל רק למיקרוטובוליים, אלא ניתן להשתמש בו כדי ליצור תבניות של ביו-מולקולות באופן כללי. וזהו. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.