יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לפתח מצע בעל תבנית דו-ממדית לבקרת ספיגת חלבונים וצמיחת תאים. דבר זה מושג באמצעות שימוש בפוטוליתוגרפיה לייצור תבנית מאסטר, המשמשת לייצור חותמת A-P-D-M-S להדפסת מגע מיקרוסקופית (micro contact printing). כשלב שני, מוכן מצע הזהב בעל התבנית, תהליך הכולל הדפסת מגע מיקרוסקופית ליצירת תבנית עם אזורים הסופגים חלבון ואזורים הדוחים חלבון.

בשלב הבא, מוסיפים חלבון ותאים למצע כדי להדמיאן את התבנית ולחקור אותה. תוצאות של צמיחה והתנהגות תאית המשיגות הן מעידות על כליאה טובה של חלבונים ותאים על מצעי תבנית אלו, בהתבסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיית ניגודיות פנים (face contrast). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון הדפסת MicroCon של חלבונים, הוא ששכבת המונולייר מסוימת הגליקול מונעת ספיחה לא ספציפית של חלבונים ותאים ברקע של התבנית.

באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יעריקו קשיים, שכן יש לאופטימיזציה של טכניקת ההחתמה המתאימה עבור כל תבנית המודפסת. כדי להתחיל בהכנת מרכז התבנית, הנח את פרוסת הסיליקון על מכשיר ה-spin coder, ובמהלך השלב הראשוני של תוכנית הסבב בעלת שני המחזורים, שטוף את הפרוסה באצטון. במהלך השלב השני של תוכנית הסבב, האצטון יתאדה וישאיר פרוסה נקייה ויבשה; בתחילת הסבב, מרח photoresist על הפרוסה ולאחר מכן בצע ציפוי במכונת סבב (spin coat) בהתאם לתנאים שתוארו קודם לכן.

בצעו אפייה רכה (Soft bake) של פרוס הווייפר המצופה בפוטורזיסט בטמפרטורה של 110 °C למשך שתי דקות באמצעות פלטה חמה בעלת אחידות גבוהה. לאחר מכן, בצעו תבנית פוטו (photo pattern) לפרוס הווייפר המצופה בפוטורזיסט באמצעות מערכת ליישור מסכות (mask aligner) ומסכה מתאימה.

ראשית, הנח את התשתית על גבי משטח הוואקום של מכשיר יישור המסיכות (mask aligner). לאחר מכן, הכנס את המסיכה למגש המחזיק והפעל את הוואקום כדי לקבע את המסיכה במקומה ולהבטיח מגע טוב בין המסיכה לתשתית. הרם את התשתית עד שתפגוש את המסיכה.

השתמשו באופטיקה של המיישר כדי לוודא שנוצר מגע טוב. לבסוף, הדליקו את המנורה כדי לחשוף את התשתית לאור UV דרך המסכה הליתוגרפית. פתחו את פרוסת הסיליקון המודפסת בתמיסת הפיתוח במשך דקה אחת ו-45 שניות, תוך כדי ערבוב עדין.

שטוף היטב במים דאיוניים בדרגת מוליכים למחצה, וייבש באמצעות זרם של גז חנקן; בדוק את פיתוח התבנית באמצעות מיקרוסקופ עם מסנן UV. התחל הליך זה על ידי הכנת תערובת של מקריש שרף ביחס של 10 ל-1 לפי משקל. ערבב את ה-cigar 180 2 באופן מלא.

כסו את פרוסת הסיליקון (wafer) בעלת תבנית הצילום בתערובת בתוך צלח פטרי חד-פעמי בתוך דסיקטור ואקום. בצעו דגזציה (Degas) למאסטר המכוסה ב-PDMS עד שלא ייראו בועות. לאחר שווידאתם שהמאסטר נמצא בתחתית הצלח, המתינו להקשחה של החותמת בתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך 1.5 שעות. כאשר חותמת ה-PDMS מקושרת, חיתכו את החותמת מהמאסטר וגזמו אותה לגודל המתאים.

שמרו את החותמת בתוך מכל מכוס כאשר הצד התכניתי פונה כלפי מעלה כדי להגן עליה מאבק ומלכלוך. כדי להכין את התשמיות להשקעת מתכת, טיפלו תחילה בכיסויי זכוכית עגולים בפלזמה של חמצן למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את כיסויי הזכוכית פעמיים במים דה-יוניים, תוך ייבוש באמצעות זרם של גז חנקן בין השטיפות; לאחר השטיפה במים, שטפו פעמיים באתנול, ושוב ייבשו באמצעות זרם של גז חנקן בין השטיפות.

באמצעות מערכת שיקוע באלומה אלקטרונית בעלת מספר תאי חומרים, שקע 50 angstroms של טיטניום ולאחריו 150 angstroms של זהב. אין לבצע פריקה (vent) למאשעת השקיעה בין שיקוע שכבת הטיטניום לשכבת הזהב. שטוף את חותמת ה-PDMS באתנול וייבש היטב.

באמצעות גז חנקן, יש להחיל את תמיסת ההחתמה על החותמת בטיפות עד לכיסוי מלא. ייבשו את החותמת היטב עם גז חנקן. הדפסת המיקרו-מגע של HEXA Decane תלויה במאפייני חותמת ה-PDMS והיא אחד ההיבטים המורכבים ביותר של פרוצדורה זו.

החתמה מוצלחת דורשת פיתוח של טכניקה טובה המפעילה לחץ אחיד. במהלך ההחתמה, עבור הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) קונבנציונלית באוויר, לחץ בעדינות את החותמת על תשת הזהב ואפשר לשכבה הבודדת (monolayer) להיווצר במשך 15 שניות.

לחלופין, עבור תבניות המורכבות ממאפיינים קטנים מאוד ויחסי גובה-רוחב גבוהים, הניחו את תשת הזהב בתוך צלחת פטרי המכילה מים דה-יוניים בעלי מוליכות של 18.2 mega Ω·cm, תוך וידוא שתשת הזהב שקועה. לאחר מכן, לחצו בעדינות את החותמת על תשת הזהב והמתינו 15 שניות להיווצרות השכבה המונו-מולקולרית. לבסוף, שטפו את התשת שהוחתמה פעמיים באתנול וייבשו באמצעות גז חנקן.

לאחר כל שטיפה, הניחו את התשתית בתוך צלחת פטרי וכסו את התשתית בתמיסת מילוי רקע. אטמו את הצלחת עם פאראפילם כדי למנוע אידוי. אפשרו לשכבת המונולייר של הרקע להיווצר בחושך למשך 12 עד 14 שעות.

לבסוף, הוצא את לבישת הזכוכית (cover slip) בעלת התבנית מתמיסת המילוי האחורית ושטוף אותה פעמיים באתנול, תוך ייבוש בגז חנקן לאחר כל שטיפה. כדי למרוח חלבון על לבישת הזכוכית בעלת התבנית, הנח את הלבישה בתוך צלח פטרי קטן או בתא לתרבית תאים. כסה ב-500 microliters עד ל-one milliliter של תמיסת סליין בבפר פוספט (DPBS). ה-DPBS חייב לכסות לחלוטין את התשתית במהלך דגירת החלבון.

כדי להבטיח כיסוי חלבון אחיד, הוסף תמיסה רכזת של חלבון ל-DPBS ועזבב את התמיסה באמצעות פיפטור מספר פעמים. דגור את תערובת החלבון עם התשתית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, שטוף את התשתית היטב עם DPBS כדי להסיר חלבון שאינו קשור, תוך הקפדה לא לייבש את התשתית ולא להעביר אותה דרך הממשק בין האוויר למים.

לאחר שלושה שטיפות, שאבו את ה-DPBS. לאחר מכן, הוסיפו כ-500 µL של מצע גידול תאים מלא כדי לשמור על תשתית רטובה. החליפו את מצע הגידול ששימש לשטיפת התשתית.

עם מצע טרי, התשתית מוכנה כעת לזריעת תאים. בדרך כלל זורעים על התשתית בין 30 ל-200 תאים לסמ"ר. תמונה זו מציגה חותמת A-P-D-M-S כפי שנראית תחת מיקרוסקופ, כאשר צד התבליט של החותמה מונח כלפי מטה על כיסוי זכוכית; סרגל הקנה הוא 100 micrometers.

החתמה נכונה מביאה לדפוס חלבון חד וברור שניתן להדמיה על ידי יישום של חלבון מסומן פלואורסצנטית, כגון fibronectin המסומן ב-LOR 6 47. הגבלת תאי chk one לדפוס החלבון מוצגת כאן. סרגי קנה מידה בתמונות אלו הם 100 micrometers.

לחלופין, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה כדי להדמיות של תבנית החלבון לאחר קיבוע SU. כאן, נעשה שימוש בנוגדן anti laminate המשולב עם LOR three 50 כדי להדגים תבנית של laminate עליה נזרעו נוירונים מהיפוקמפוס של עכבר ביום E 18, כפי שמוצג לאחר ארבעה ימים in vitro. נוירונים מהיפוקמפוס של עכבר ביום E 18 שנצבעו ב-MIT tracker red five 80 מראים כי צמיחת התאים מוגבלת היטב לתבנית החלבון. בעוד שניתן לשלוט בטכניקה זו בקלות, עשויות להופיע מספר בעיות נפוצות, כפי שמוצג בהכנות של תשתי תבנית אלו שהודמיו באמצעות ספיחת fibronectin המשולבת עם LOR 6 47.

יישום של חלבון ללא ערבוב מספיק של תמיסת החלבון המרוכזת ב-DPBS עלול להוביל לתבניות חלבון לא אחידות. הטבעה שגויה עלולה להוביל להעברה חלקית של התבנית או לקריסת החותמת. בנוסף, חשיפה של תשת התבנית המכילה חלבון ספח לאוויר עלולה לשבש את השכבה האحادית ולגרום לירידה בהתנגדות.

בסביבת העבודה, דפוסים תת-מימיים יכולים להפיק דפוסים בעלי מאפיינים קטנים שקשה להדפיס באמצעות הדפסת מיקרו-מגע קונבנציונלית ובאוויר. שתי תמונות אלו מראות אזורים שונים של אותו דפוס שהודפס עם אותו חותם PDMS באוויר או במים דה-יוניים; קווי תמיכה מוצגים בתמונה השמאלית כדי להדגים שרק המאפיינים הקטנים של הדפוס לא הודפסו בהצלחה. סרגי קנה המידה הם 20 micrometers. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 18 עד 24 שעות, אם היא מבוצעת כהלכה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של אופן ייצור תשתית תבנית. ייצרו חותמת PDMS. השתמשו בהדפסה במגע מיקרוסקופי (micro contact printing) כדי להכין תשתית זהב בעלת תבנית, והדמינו תבנית זו באמצעות חלבונים ותאים.