לדמיין את הלב הפועם תסיסנית

שתי טכניקות יוצגו כאן לצורך הדמיה של לב פועם ב-Drosophila עבור דיסקציה של לב בוגר. ראשית, הראש והחזה מוסרים באמצעות חיתוך בודד לאורך הקו המסומן. לאחר מכן, איברי המין מוסרים וחלל הבטן נפתח באמצעות פינצטה; המעי, ובמקרה של זבוב נקבה, השחלות מוסרות.

גוף השומן הבטני במקטעים הבטניים שלושה וארבעה נשאב בזהירות כדי לחשוף את לב הבוגר לצורך קיבוע של לב הזחל. זחל בודד המונח בתמיסת בופר מקובע על ידי מריחת דבק histo acral תחילה מסביב לאזור ראש הזחל. הזחל נמתח בעדינות ודבק נוסף נמרח בקצה האחורי, ולאחר מכן בדפנות של דופן גוף הזחל.

שלום, אני GI Fler. שלום, אני Karen er. שנינו חברים בתוכנית לפיתוח והזדקנות במכון ברנהם למחקר רפואי (Burnham Institute for Medical Research).

היום נדגים את הפרוטוקולים שפיתחנו להדמיה של לב פועם של זבובי פירות (*Drosophila*) בשלבי הפופה (larval) והבגרות. אנו משתמשים בשתי ההכנות הללו כדרך להדמיות, לבחינה ולכימות של פרמטרים של קצב הלב בזבוב הפירות, *Drosophila*. לפני שנתחיל, נכין תחילה תמיסת המולימפה מלאכותית.

תמיסה זו מכילה סוכרוז, helo, שיש להוסיף לתריף הדם (hemolymph) המלאכותי ממלאי תמיסות מקור קרירות רגע לפני השימוש. על מנת למנוע זיהום חיידקי, יש להביא את התריף המלאכותי לטמפרטורת החדר ולהעשיר את התמיסה בחמצן באמצעות בועית אוויר למשך 15 דקות לפחות. לאחר מכן, יש למשוך מספר קפילריות דקות באמצעות שובך פיפטות סטנדרטי, שיידרשו לצורך הסרת גופי שומן בזבוב.

לאחר שכל ההכנות הושלמו, יש להרדימ את הזבובים הבוגרים. ניתן לעשות זאת באמצעות חשיפה קצרה ל-fly nap למשך שתיים עד חמש דקות, אך יש להיזהר שלא להשאיר את הזבובים ב-fly nap למשך יותר מחמש דקות. ניתן להשתמש גם בחשיפה קצרת מועד לקור כדי להרדימ את הזבובים, אך שימוש בפחמן דו-חמצני אינו מומלץ מכיוון שיש לו השפעות ממושכות יותר על קצב הלב והתנועתיות.

בשלב הבא, הזבובים המורדמים מונחים כשצדם הגבי (dorsal) פונה כלפי מטה לתוך צלחת פטרי המצופה בשכבה דקה של וזלין. הקוטיקולה ההידרופובית בכנפיים ובגוף אמורה להיצמד באופן הפיך לוזלין, אך ניתן למקם מחדש את הזבוב במידת הצורך. חתך ראשוני מבוצע באמצעות מספרי קפיץ קמורים.

פעולה זו מתבצעת על ידי הנחת להבי המספריים מתחת לרגלי הזבוב ובזווית כלפי מטה לכיוון השטח הגבי (dorsal) סמוך לצוואר. לאחר החיתוך, הראש, שרשרת העצבים הגחונית (ventral nerve cord) והרגליים מוסרים בחיתוך אחד. לאחר מכן, הדגימה טובעת בתוך תמיסת המולימפה המלאכותית המועשרת בחמצן באמצעות מספרי קפיץ.

את הקצה האחורי של הבטן, המורכב ממקטעים בטניים שבעה ושמונה, מסירים בחיתוך אחד. פעולה זו מאפשרת גישה לביצוע חיתוכים לצדיים לאורך שני קצות הבטן ומשמשת לניתוק הקשר בין המעי האחורי לבין הקוטיקולה של הבטן. יש להחדיר את להבי המספריים לתוך הפתח הקטן בקצה הבטן ולחתוך את הקוטיקולה לצדדים.

פעולה זו משחררת קצה אחד של הקוטיקולה הוונטרלית (הבטנית). תפסו את השלוף בעזרת פינצטה ובצעו חיתוך דומה לאורך הקצה הלטרלי (הצדי) הנגדי של הבטן. כעת ניתן להסיר את השלוף המשוחרר של הקוטיקולה הוונטרלית של הבטן.

ניתן להסיר בדרך כלל את המעי ואיברים בטניים אחרים כמסה אחת באמצעות פינצטת תכשיט ומשיכה עדינה. הסרת האיברים הפנימיים חושפת את צינור הלב הפועם, שעדיין מחובר לקוטיקולה הגב באמצעות שרירים אווריריים קטנים ומוקף בגופי שומן. את הנימיים שנמשכו מכניסים לתוך צינורית פלסטית בקוטר 1/16 אינץ' המחוברת למקור ואקום.

כוח השאיבה פרופורציונלי לקוטר הטיפ, לכן אין להשתמש בפיפטות עם טיפים שקוטרם גדול מ-40 microns לאחר ההגדרה. מערכת שאיבה זו משמשת לשאיבת עודפי שומן מסביב לצינור הלב. ניתן להשתמש בה גם להסרת בועות אוויר שהצטברו סביב הקוטיקולה וכן להסרת שאריות.

יש לנקוט זהירות רבה כדי להימנע ממגע בלב עצמו, ומכיוון שהחלק האחורי של הלב שברירי מאוד, יש להימנע ממגע גם באזור זה. צינור הלב של ה-drosophila הבוגרת חשוף כעת ואמור לפעום במידת הצורך. ניתן למקם מחדש את הקוטיקולה ואת הלב המחובר אליה על ידי הרמה עדינה של הקוטיקולה מו-וזלין והחזרתה בזהירות למקומה.

יש להימנע מכל מגע עם רקמת הלב. בשלב זה, יש להחליף את התמיסה שבה טבולה הדגימה בהמולימפה מלאכותית טרייה. יש לאפשר לדגימה להגיע לשיווי משקל במשך 20 עד 30 דקות עם חממצון לפני ביצוע מניפולציות כלשהן.

אם יש לתחזק את התכשיר למשך יותר מ-60 דקות, יש לבצע לו פרפוזיה חוזרת עם המולימף מלאכותי טרי. תכשיר זה מוכן כעת לשימוש להקלטה אופטית, וניתן להשתמש בו גם להקלטה אלקטרופיזיולוגית או למניפולציות היסטולוגיות. לצורך ויזואליזציה של דפיקות הלב בתוך הzלרוות נדרשת טכניקה שונה.

ראשית, הכינו את לביבות הכיסוי יום לפני הפרוצדורה. הדבר נעשה על ידי שימוש בקיסם העברה כדי להעביר כ-50 עד 70 µL של תמיסת Sylgard על לביבת כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר. הניחו ל-Sylgard להתקשח בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה.

בשלב הבא, הכינו את בופר Brody and Bates; ברגע שהבופר מוכן, ניתן לאחסן מנות (aliquots) בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס ולהפשירן בעת הצורך. לבסוף, הכינו את הכלים הדרושים למריחת דבק histo acral. ראשית, משכו מספר קפילריים דקים.

בשלב הבא, חברו טיפ של פיפט בנפח 1.5 מיליליטר לצינורית פלסטיק קטנה שקוטרה כ-1/32 אינץ'. הכניסו את הקצה הצר של צינורית קפילרית אל תוך הצינור, כך שפתחה הרחב פונה לצד השני. לאחר ההכנה, טענו את הקפילרית בדבק היסטולוגי (histo glue) על ידי טבילת הקפילרית בטיפת דבק ויניקה עדינה אל תוך טיפ הפלסטיק.

בעת עבודה עם הדבק, יש להחזיק בהישג יד קפילרית זכוכית שנייה כדי להסיר עודפי דבק מקצה קפילרית הדבק. הדבק נשאר נוזלי עד למגעו עם תמיסת סלין מנוטרלת (buffered saline), שבה הוא יתקשה תוך מספר שניות. עם זאת, הוא בדרך כלל נשאר פלסטי למשך זמן מספיק כדי שניתן יהיה להסירו מקצה קפילרית הדבק או בזמן יישומו על הדגימה.

כעת, כדי להתחיל בקיבוע של הזחלים, הניחו טיפה של דבק histo acral קרוב לכל פינה של ה-syl guard. הוסיפו 50 microliters של בופר B and B לטיפות הדבק, אשר יתקשו באופן מיידי, ומלאו את החלל שבין נקודות ההדבקה ב-b and b. הדבק ישמור את הבופר על העששית.

קחו זחל בשלב L3 בשלב נדידה והניחו אותו על פיסת נייר סופג רטוב על קרח למשך שתי דקות. פעולה זו תאט את תנועתו. לאחר מכן, העבירו את הזחל לתוך הבאפר והכווינו אותו כך שהצד הגבי יהיה כלפי מעלה.

זהו צדו של הזחל שבו חסרות החגורות הזהות. מרחו במהירות מעט דבק בין אזור הראש לבין מגן הסף. הדבק יתקשה במהירות רבה וימנע את תנועת ראשו של הזחל.

בעזרת פינצטה, תפסו בזהירות את החיה בסימנים האחוריים ומתוחו אותה בעדינות. קבעו את הזחלים במצב זה על ידי מריחת דבק לאורך שני צדי הזחלים בחצי האחורי. כדי להפחית תנועה נוספת של הקוטיקולה על ידי שרירי דופן הגוף, הוסיפו דבק נוסף לצדדי החיה.

הזחל מקובע כעת בתנוחה זו. ניתן להניח את זכוכית הכיסוי בתוך צלחת פטרי קטנה מלאה בהמולימפה מלאכותית או ב-PBS, וכעת ניתן להקליט את פעימות הלב ללא הפרעה מתנועות דפנות הגוף. לב של זבוב דרוזופילה בוגר, חצי-שלם, יפעם באופן קצבי במשך שעות לאחר הניתוח, כאשר הוא נשמר בהמולימפה מלאכותית רעננה ומחומצנת.

דוגמה מייצגת מוצגת כאן ובסרטון ההשלמה הראשון; לבבות מzশ্রেণীর זחלים בשלב השלישי המוצגים כאן, ובזבובים צעירים בגיל שבוע עד שלושה שבועות לאחר הבקיעה, מראים בדרך כלל פעימות לב סדירות בקצב שבין 1 Hz ל-3 Hz; זבובים בני יותר משלושה שבועות הם בדרך כלל לא רסמיים יותר. עם זאת, לבבות אלה עדיין מסוגלים לפעום באופן ספונטני במשך שעות בתוך המולימף מלאכותי מחומצן; לבבות של זבובים בוגרים שנפגעו כתוצאה מהליך הניתוח מראים בדרך כלל אזורים מקומיים של התכווצות קיצונית שאינם מסוגלים להירפות ולעתים קרובות פועמים ללא שליטה. קצבי פעימות לב נמוכים מ-1 Hz נצפים לעיתים נדירות בזבובים בני פחות משלושה שבועות.

כתוצאה מכך, תכשירי בידוד כאלה נחשבים לפגומים ונזרקים. הדגמנו כעת כיצד להכין לבבות של זבוב פירות בוגר ובשלב התפתחותי לצורך דימוי אופטי. זכרו, בעת הכנת התכשיר החלקי, לעולם אין לגעת בלב עצמו.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.