ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים
16 בנובמבר 2009
אנו מציגים דרכים שונות כדי לפקח על תפקוד הלב של הזחל תסיסנית להערכת שאלות להתמודדות עם הפונקציה של צמתים הפער, מוטציות ערוץ יון, מודולציה של פעילות קוצב לב ומחקרים פרמקולוגיים.
זבוב הדרוזופילה (Drosophila) הוא דגם גנטי אטרקטיבי לחקר הפיתוח והתפקוד של הלב ושל פעילות קוצב הלב שבבסיסו. פרוצדורה זו מדגימה כיצד להכין דגימות של פגליות שלמות ושל פגליות לאחר נתיחה, וכיצד לנטר את קצב הלב. הדגימה שנתיחה מאפשרת גם הקלטות של פוטנציאלים חוץ-תאיים או תוך-תאיים כדי לבחון לעומק את תפקוד תעלות היונים.
שלום, אני רובין קופר, חבר סגל במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קנטקי. היום תלמידיי, אן קופר, קיילה ריימן, מאט וורד ואיסטר בוקו, יציגו בפניכם פרוצדורות שונות לניטור קצב הלב בפסיונות זבוב הדרוסופילה (Drosophila larvae). השיטה הבאה, ללא ריסון, נקראת "חוות נמלים" כיוון שהזבובים נצפים במישור מוקד אחד.
לקבלת הוויזואליזציה הטובה ביותר של הלרוות, השתמשו במיקרוסקופ דיסקטור עם עדשה בסיסית של 2x ועדשת עינית של 0.5x, כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית וההגדלה המיטביות על פני מלבן של 1 סנטימטר על 0.5 סנטימטר. ניתן להקליט תצלומים וסרטונים באמצעות מצלמה המותקנת על התושבת של העינית. כדי להתחיל בשיטה זו, הניחו לרבה בין שתי זכוכיות כיסוי עם שכבה דקה של מזון ביניהן.
הזجاجיות מוחזקות במרחק של 1 עד 1.5 מילימטרים זו מזו באמצעות ספייסרים מפלסטיק בכל ארבעת הצדדים. הטה את הדגימה בזווית של בין 20 ל-45 מעלות למשך מספר דקות כדי לעודד את הלרווה לשמור על ראשו מופנה כלפי מטה. כוון את מראת המיקרוסקופ לקבלת הניגודיות המיטבית של הלב או של שתי הקששסוֹת (trachea) כדי לצפות בפעימות הלב.
שיטת ההדבקה היא שיטת קיבוע קבועה לריסון זחלים על עלית זכוכית. כדי להתחיל בשיטת ההדבקה, הניחו כיסוי זכוכית נקי על גבי עלית זכוכית. הניחו טיפה קטנה של דבק מהיר בפינה אחת של כיסוי הזכוכית.
בשלב הבא, שטפו את הזחלים במים. כדי להסיר שאריות מזון, ספגו את הנוזל באמצעות טישיו או פינה של נייר סופג. לאחר שהזחל נשטף היטב, הרימו אותו בעדינות בעזרת פינצטה נקייה והניחו אותו על התובית, הרחק מזכוכית הכיסוי, תחת המיקרוסקופ, כאשר הזחל מונח על בטנו.
על קיבתו ייראו חריצים אופקיים עמומים עם שערות שחורות דקיקות. גבם של הזחלים צריך להיות פונה כלפי מעלה, ובו שני פסים מקבילים המהווים את הטרכיאה. באמצעות סט פינצטות שני המיועד אך ורק לטיפול בדבק, קחו כמות קטנה מהטיפה שבקצה הזז והניחו אותה בפינה בצד הנגדי.
השתמשו בכמות מזערית, רק מספיק כדי לכסות את ראש הפינצטה. הרימו את החיה והניחו אותה על הדבק תוך כדי וידוא שהיא נשארת בצד הבטן כלפי מטה בתוך הפה השחור.
הווים צריכים להיות בקצה של כיסוי הזכוכית או קרוב אליו, כולל ווים הפה והספירלה החומה. אסור להם לגעת בדבק. לחץ בעדינות על ה larvae כדי לשטוח אותה.
כדי להחיל את חומר הבדיקה, מומלץ להחליט טיפות קטנות באמצעות מזרק בסמוך לראש הזחלים. יש לעקוב אחר קצב הלב על ידי ספירת מספר הפעימות של הספירלות בדקה אחת. עבור תצפיות ממושכות יותר, ניתן להאכיל את הזחלים במקומם ולהרטיב אותם כדי למנוע התייבשות. כדי להכין פלטת נתיחה שניתן להשתמש בה תחת המיקרוסקופ, השתמש בסכין מנתח (scalpel) כדי לחתוך חור בקוטר של 2 cm במרכז חתיכת סרט מגנטי והדבק אותה לעלית זכוכית.
השתמשו בסיכות נתיחה שכוופפו והודבקו למהדקי נייר כדי להקל על הקיבוע. במהלך הנתיחה, הניחו פלבה של זחלי כוכב שלמה על לוח הנתיחה. כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, הקנה צריך להיות נראה דרך הקוטיקולה.
מקמים שני סיכות ב larvae משני צדדיו של ה-mouth hooks, ושתי סיכות נוספות משני צדדיהם של ה-spirals. לאחר מכן, מוסיפים saline כדי לשמור על ה-larvae לחים. לאחר מכן מבצעים חתך אופקי ליד ה-coddle end, ואחריו חתך אורך שיוסיף להמשיך לצד ה-spirals לכיוון ראש החיה.
הרימו סיכה גבית אחת והשחילו אותה מתחת לקוטיקולה. השתמשו בסיכה כדי להרחיב. פתחו את חלל הגוף.
חזור על הפעולה עם שלושת המסמרים האחרים. לאחר שהבעל חיים קובע במקומו כשהוא פתוח, הסר את האיברים הפנימיים תוך זהירות כדי לא לפגוע בטרכאה או בלב. מבנים מסוימים, כולל המוח וגופי שומן מסוימים, מחוברים ללב ועלולים לגרום לנזק לו בעת הסרתם.
יש להניח להכנה להירגע באמבט של תמיסת HL three saline למשך שלוש עד חמש דקות לאחר הניתוח; רישומים תוך-תאיים ורישומי שדה מבוצעים בהכנה זו בעוד שחומרים פרמקולוגיים מיושמים ישירות על הלב. הזמן הכולל לשלב ניתוח זה הוא שלוש עד שש דקות. לצורך ביצוע קוצב חשמלי, יש להכין תחילה אלקטרודות מוקדיות; כדי להכין אלקטרודה מוקדית, העבירו אלקטרודת זכוכית מעל גוף חימום לצורך ליטוש באש (fire polish) וצרו כיפוף הדרגתי של כ-45 מעלות, לאחר מכן הרכיבו על המניפולטור אלקטרודה מוקדית מלאה בתמיסת HL three saline בטמפרטורת החדר, כאשר הקצה פונה כלפי מטה.
וודאו שחוט המעורר נוגע בתמיסת המלח בתוך האלקטרודה ושהמעורר כבוי. הצמידו למסגרת המיקרוסקופ דגימה טרייה של נתיחה של לב. הניחו את חוט ההארקה בתוך תמיסת המלח.
הקפידו לא לגעת בפינים או להפריע להכנה. שמרו על מיקוד באלקטרודה תוך שימוש במניפולטור כדי להוריד אותה לתוך התמיסה המלוחית. ברגע שהיא נמצאת בתמיסה המלוחית, מקמו את קצה האלקטרודה כך שהלומן יהיה שטוח כנגד הלב ונוגע בו קלות.
לאחר מיקום האלקטרודה, הגדירו את תדר הגירוי ל-two hertz כאשר המתח נמצא בהגדרה הנמוכה ביותר. הפעילו את הגירוי. כווןנו את התדר לכ-three hertz והעלו לאט את המתח עד שקצב הלב יאיץ כך שיתאים למקצב של המגרה.
כעת ניתן לשלוט במקצב באמצעות הסטיםולטור. ניתן להוסיף תרכובות כדי לבחון אם הן משפיעות על ההתכווצות או על ההולכה החשמלית. לביצוע הקלטות פוטנציאל שדה, מלאו אלקטרודת הקלטה מסוג macro patch בתמיסת רחצה והרכיבו אותה על מניפולטור מעל מיקרוסקופ מורכב.
חברו את האלקטרודה למגבר ולמתקן הקלטה. השתמשו במניפולטור כדי להוריד את לומן האלקטרודה מעל לב של תכשיר ניתוח המקובע למיקרוסקופ. געו קלות מאוד בלב עם קצה האלקטרודה.
ניתן כעת לבצע הקלטות שדה כדי להקליט פוטנציאלי שדה מאזור אחר של הלב. הרם בעדינות את קצה האלקטרודה והזז אותו לאזור חדש באמצעות המניפולטור, ולאחר מכן בצע שוב הקלטות של פוטנציאל השדה בקצה. אפשר ניטור מדויק של קצב ומשך האותות החשמליים בלב כדי למדוד פוטנציאלים טרנס-ממברנליים של מיוציטים בעוברי זחלים.
ראשית, ודאו כי הלומן של אלקטרודה חדה המלאה ב-three molar potassium chloride נשען בצורה שטוחה על הלב בזווית של כ-45 מעלות מהאנך. לאחר מיקום נכון, געו בעדינות בלב עם קצה האלקטרודה והחדירו את הקצה לתוך תא. ניתן להשתמש באלקטרודה שוב אם היא לא נשברה.
ההקלטות התוך-תאיות מאפשרות למדוד את הבסיס היוני של פוטנציאל הפעולה ואת הצורות האופייניות של הפוטנציאלים כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות בתעלות יונים או של מודולטורים של תעלות. כך שהראינו לכם כעת כיצד לבצע הקלטות מהלב, וכן כיצד למדוד פוטנציאלים תוך-תאיים ופוטנציאלי שדה. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי לבחון שינויים בלב, כמו גם מניפולציות פרמקולוגיות ושינויים גנטיים.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב להימנע ממשיכה של מבנה קשור המחובר ללב או מלחיצה חזקה מדי עם האלקטרודה המוקדית. כמו כן, בשימוש בשיטת הדבק, יש להיזהר לא להדביק את הפיה או את הכדור כך שיהיו סגורים. זהו התהליך.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטות לניטור תפקודי הלב בפסילת Drosophila, תוך התמקדות בהערכה של צמתי פער (gap junctions), מוטציות בתעלות יונים ופעילות קוצב הלב. הטכניקות כוללות both הכנות שלמים ושלבים מבודדים לצורך ניתוח מפורט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- גנטיקה
רקע
- זבובים מסוג Drosophila הם בעלי ערך רב לחקר התפתחות הלב ותפקודו.
- הבנת פעילות קוצב הלב היא קריטית להשגת תובנות לגבי פיזיולוגיה לבבית.
- ניתן להעריך את תפקוד תעלות היונים באמצעות מערכים ניסיוניים שונים.
- מחקרים פרמקולוגיים יכולים לחשוף את השפעתם של תרכובות שונות על תפקוד הלב.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקות לניטור קצב הלב בפסילוני Drosophila.
- לבחינת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על תפקוד הלב.
- לספק מתודולוגיה מפורטת הן עבור דגימות שלמות והן עבור דגימות מופרדות (dissected).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שיטת ויזואליזציה ללא קיבוע באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
- שיטת הדבקה להרכבה קבועה של זחלים על תגליות.
- טכניקות דיסקציה (ניתוח) להגעה ללב ולקנה הנשימה.
- קוצב חשמלי והקלטות פוטנציאל שטח להערכת פעילות הלב.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של קצב הלב בהכנות זחלים שונות.
- הדגמה של השפעותיהם של חומרים פרמקולוגיים על התכווצויות הלב.
- אספקת פרוטוקול ברור לניתוח ולמיקום האלקטרודות.
- הצגת ההיתכנות של שימוש ב-Drosophila למחקרי לב.
מסקנות
- זחלי דרוזופילה הם מודלים יעילים לחקר תפקודי הלב.
- ניתן להתאים את השיטות המתוארות לצרכים ניסויים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקות אלו כדי להעמיק את חקר הפיזיולוגיה של הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מודלים של לב זחלי Drosophila מאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית של תפקוד תעלות יונים ובקרים (pacemakers) בשלבים מוקדמים של הגילוי, ובכך תומכים בתיקוף מטרות עבור מסלולים הקשורים למערכת הלב. ההכנה מספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של קצב הלב והפעילות החשמלית, ובכך מקלה על פיתוח בדיקות לסריקת תרכובות. מערכת זו מציעה מודל רלוונטי למחלה וניתן לשליטה גנטית להערכת הפוטנציאל של ביומרקרים תרגומיים וביטחון ניבוי בזיהוי מולקולות מובילות (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לתפקוד תעלות יונים ופעילות קוצבי לב במערכת נגישה גנטית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות ליישום ישיר של סוכנים פרמקולוגיים על הלב החשוף.
- ערך ניבוי: מספק מדידות כמותיות של קצב הלב ופוטנציאלים של קרומי התאים להערכת מעורבות המטרה ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר פלטים סטנדרטיים וכמותיים (קצב לב, פוטנציאלי שדה, הקלטות תוך-תאיות) להערכה מהימנה של תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור של הבדיקה באמצעות תכשירים מופרדים המאפשרים חשיפה מבוקרת לתרכובות ובקרה סביבתית.
- יכולת הרחבה: ניתן להשתמש בתכשירים של לבבות מופרדים לצורך התאמה לפורמט של מספר בארות כדי לתמוך בסריקה בעוצמה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: הכנת לב של זחלים משמשת כמערכת רלוונטית למחלה למידול תקלות יוניות הקשורות לגנים ספציפיים הקשורים למחלות לב ביונקים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מאפשרת בחינה של הבסיס היוני של פוטנציאלי פעולה והשפעות של מוטציות בתעלות יונים או של מודולטורים, ובכך מפחיתה עמימות מנגנונית.
- המשכיות ניבוי: תומכת בתיאום של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קישור אלקטרופיזיולוגיה של זחלים למנגנונים יוניים ידועים באורגניזמים גבוהים יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומספקת תובנות מכניסטיות המייגדות את הערכת הסיכונים הפרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי תרומתם של תעלות יונים וקוצבי לב לתפקוד הלב באמצעות קריאות אלקטרופיזיולוגיות ישירות.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של קצב הלב ופוטנציאלים, המאפשרות השוואה בין תרכובות או תנאים גנטיים שונים.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים אלקטרופיזיולוגיים (קצב לב, פוטנציאלי ממברנה, פוטנציאלי שדה) המסייעים לצוויות להעריך את השפעת התרכובות על ההולכה החשמלית והכיווץ.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות מידול של זרמים יוניים העומדים בבסיס פוטנציאלי פעולה, הרלוונטיים לפתופיזיולוגיה של לב יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה לשימוש חוזר עבור פנוטיפ לב ברחבי פרויקטים מרובים הכוללים מטרות של תעלות יונים או מודלים של מחלות גנטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות למדדי תפקודי לב.
- ערך תפעולי: מספק הכנות סטנדרטיות וניתנות להרחבה המפחיתות שונות ותומכות בעקביות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים מכניסטיים מוקדמים על סיכונים לבביים הקשורים לתעלות יונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על בטיחות לבבית ופרופילי מעורבות מטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בניתוח ובטכניקות של רישום אלקטרופיזיולוגי.
- תלוי במיקרוסקופיה, במניפולציה של אלקטרודות ובחומרת גירוי עבור רישומים תוך-תאיים ושל פוטנציאל שדה.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון הניתוח, הרכב התמיסה המלוחית ומיקום האלקטרודות בין משתמשים ומעבדות שונות.
- שיקולי התאמה כוללים את האנטומיה הספציפית של הלב למין ואת ההרכב היוני בעת הרחבה למודלים של חרקים או חסרי חולר אחרים.
- מגבלות מעשיות כוללות את יציבות ההכנה לאורך זמן ונזק אפשרי לרקמה במהלך הניתוח, העלולים להשפיע על איכות הרישום.
